Partial purification and characterization of NADH-cytochrame b5 reductase from mullet liver microsomes

oz NADH-SITOKROM b5 REDUKTAZ ENZİMİNİN KEFAL KARACİĞER MİKROZOMLAREVDAN KISMİ OLARAK SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU KABAKLAR, Zahide Yüksek Lisans, Biyokimya Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Emel ARINÇ Ocak 1998, 108 sayfa NADH-sitokrom b5 redüktaz enzimi deterjan ile çözünürleştirilmiş kefal karaciğer mikrozomlarının birbiri ardından iki DEAE-sellüloz ve 5' ADP agaroz afinite kolon kromatografilerine uygulanması ile saflaştırıldı. Başlangıçtaki mikrozomlara oranla %10'luk bir verim ile 52.1 kez saflaştırılmış olarak elde edildi. Yaklaşık monomer moleküler ağırlık, SDS-poliakrilamit jel elektoforezi ile 33800 ± 1000 olarak bulundu. Ferrisiyanit elektron alıcısı olarak kullanıldığında, redüktaz pH 6.5 ve 7.5 arasında optimum aktiviteyi gösterdi. Sitokrom b5 substrat olarak kullanıldığında ise, maksimum enzim aktivitesi iki farklı pH da, 6.5 ve 8.5, elde edildi.Ferrisiyanit indirgenmesi için maksimum enzim aktivitesi 25 °C de gözlendi. Enzim, 37 °C de aktivitesinin %45 ini kaybetti. Ferrisiyanit için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 50 uM ve 86.9 umol indirgenmiş ferrisiyanit/dak/mg olarak hesaplandı. Kofaktör NADH için Km ve Vmax değerleri doygunluk konsantrasyonunda ferrisiyanit varlığında, 45.4 uM ve 113.4 umol indirgenmiş ferrisiyanit/dak/ mg olarak bulundu. Kefal redüktaz enzimi tarafından sitokrom b5 indirgenmesinin Michaelis-Menten kinetiğine uymadığı gözlendi ve yaklaşık Km değeri 3 uM olarak bulundu. Sitokrom c indirgenme kinetiği sitokrom b5'in fonksiyonu olarak, sitokrom c ve sitokrom b5 redüktaz varlığında incelendi. Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0.016 uM sitokrom b5 ve 26.6 umol sitokrom c/dak/mg enzim olarak bulundu. Sonuç olarak, balık karaciğer sitokrom b5 redüktaz enzimi memelilerden elde edilen karaciğer redüktazlanna bazı özellikler yönünden benzemekte iken, optimum sıcaklık ve sitokrom b5 kinetiği yönünden farklı özellikler göstermektedir. Anahtar kelimeler: Kefal, sitokrom b5 redüktaz, saflaştırma, karakterizasyon, balık karaciğeri, mikrozom, kinetik, sitokrom c indirgenmesi. vı ABSTRACT PARTIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF NADH- CYTOCHROME b5 REDUCTASE FROM MULLET LIVER MICROSOMES KABAKLAR, Zahide M.S., Department of Biochemistry Supervisor : Prof. Dr. Emel ARINÇ January 1998, 108 pages NADH-cytochrome b5 reductase was partially purified from detergent solubilized mullet liver microsomes by using two successive DEAE-cellulose, and 5'-ADP-agarose affinity column chromatographies. It was purified 52.1-fold and the yield was 10% with respect to microsomes. The apparent monomer Mr of reductase was determined to be 33800 ± 1000 by SDS-PAGE. When ferricyanide was used as an electron acceptor, reductase showed optimum activity between pH 6.5 and 7.5. The maximal activity of the enzyme with cytochrome b5 as a substrate was obtained at two different pH values, pH 6.5 and pH 8.5. The maximum activity of the enzyme for ferricyanide reduction was observed at 25 °C. Reductase lost 45% of its activity at 37 °C. K`,and Vnux values mof the enzyme for ferricyanide were calculated as 50 uM and 86.9 umol ferricyanide reduced/min/mg enzyme. The Km and Vmax values for the cofactor NADH in the presence of saturating amounts of ferricyanide was found to be 45.4 uM and 113.4 umol ferricyanide reduced/min/mg. On the other hand, cytochrome b5 reduction by mullet reductase did not obey Michaelis-Menten kinetics, and apparent Km for cytochrome b5, although not accurate, was determined as 3 uM. Kinetics of cytochrome c reduction as a function of cytochrome b5 in the presence of cytochrome c and cytochrome b5 reductase were investigated and the Km and Vmax values were found as 0.016 uM cytochrome b5 and 26.6 umol cytochrome c reduced/min/mg enzyme. The results suggest that some properties of fish liver cytochrome b5 reductase are similar to those of mammalian liver while optimum temperature and reduction of cytochrome b5 kinetics of fish enzyme are different from those of mammals. Keywords: Mullet, cytochrome b5 reductase, purification, characterization, fish liver, microsomes, kinetics, cytochrome c reduction. IV 108