Behçet hastalığında rol alan yeni immunogenetik antijenlerin SEREX metodu ile belirlenmesi

Behçet hastalığı, mukokutanoz lezyonlar, artrit, venöz tromboz, arter anevrizması, intestinal ülserler, akciğer ve merkezi sinir sistemi lezyonlan ile pek çok organ ve doku tutulumu gösterebilen, sistemik inflamatuvar bir hastalık olarak tanımlanmaktadır Behçet hastalığının patogenezi bilinmemektedir. Patolojisinin temelinde, kontrolsüz olarak artmış bir immün yanıtın olduğu ileri sürülmektedir. Genetik olarak yatkınlığı olan kişilerde çevresel ajanlar ve çeşitli mikroorganizmalar tarafından inflamatuar yanıt başlatılabilmektedir. Alternatif olarak, Behçet hastalığının kökeninde birincil olarak otoimmünite olabilir denmektedir. Behçet hastalığında bazı otoantij enlere yönelik immün cevabın varlığı gösterilmiştir. Örneğin, anti-endotelial hücre antikoru, non-spesifik bulgu olmasına rağmen hastalarda sık rastlanmaktadır. Retinal S antijen, retinada ifade edilen ve hastalarda üveit ile ilişkili antikorların geliştirebildiği bir otoantij endir. Diğer olası aday otoantij enler içinde, ısı şoku proteinleri (hsp), tropomiyosin ve okside düşük yoğunluklu lipoprotein yer almaktadır. Bununla birlikte, bu antijenlerin gerçekten patojenik olup olmadıkları veya onlara karşı direkt immün cevabın hastalık aktivasyonu ile bağlantılı non spesifik inflamatuar reaksiyondan kaynaklanıp kaynaklanmadığı hala bilinmemektedir. Bu çalışmada, SEREX metodu ile Behçet hastalığına özgü yeni antijenlerin belirlenmesi amaçlandı. SEREX (Serological Analysis of cDNA Expression libraries), yüksek titre IgG antikorlarını meydana çıkaran insan tümör antijenlerini belirlemek amacıyla, serolojik analiz yöntemini antijen klonlama teknikleriyle birleştirmek için geHştirilmiştir. SEREX metodu kullanılarak yapılan araştırmalar sonucu, birkaç otoimmün hastalıkta, bazı otoantikorların varlığı belirlenmiştir. Bugüne kadar çalışılan otoimmün hastalıklar, dev hücreli arteritis, sistemik skleroz, sistemik lupus eritromatozus, IDDM, panuveite neden olan bazı hastalıklar, Sjogren Sendromu ve polimiyaljiya römatikadır. Bu çalışmada, SEREX metodu ile Behçet hastalığı patogenezinde rol alabilecek antijenlerin belirlenmesi amaçlandı. Bunun için çalışmamızda, dört Behçet hasta örneğinden oluşturulan ilk serum havuzu, SEREX ile, insan testis cDNA 94ekspresyon kütüphanesinde tarandı. Tarama sonucunda 20 pozitif klon belirlendi. Bu 20 örneğe ait dizileme sonuçlarına göre, klonlardan 13 tanesi OMIM de kayıtlı (ribozomal protein L3, ubikutin spesifik proteaz 29-USP29, imidazolin-1 -reseptör, sitokromB, kinesin hafif zinciri, p68 RNA helikaz, AKAP450, kinektin, ubikutin spesifik proteaz28, JK-rekombinasyon proteaz, EEA1- erken endosom bağlantılı antijen Agl, C-NAP1 ve 7 tanesi ise kabul numarası almış imaj klonlara veya fonksiyonu tam olarak bilinmeyen genlere (Image klon, Putative NY-REN37 antijen isoform 2/ nuclear protein Ukp68, Kinesin benzeri 8,transcript varyantı, Hs trigger transposable element derivation 4 -TIGD4, Zayıf peregrine benzeri klon, Ras association domain family4 -RASSF4 ve KIAA1074 benzeri gen ürünü) ait diziler olduğu gösterildi. Bu antijenlerin seroepidomiyolojisi çalışmasında, belirlenen antijenlere karşı antikor reaksiyonları sıklığı, Behçet hasta alt grubu serumlarında (n=31) ve kontrol serumunda (n=30) serolojik plak analizi ile uygulanarak belirlendi. Belirlenen genlerin, Behçet hastalığının gelişimi ve ortaya çıkışma ait parametrelerle ilişkisinin anlaşılması için, belirlenen antijenlere karşı elde ettiğimiz seroreaktivite sonuçlan ve klinik veriler arasındaki korelasyonunun değerlendirildi. Belirlenen antijenlerin Behçet hasta alt gruplarındaki ve normallerdeki dağılımları bakıldığında, hastalar ve kontroller arasında, herhangi bir antijenin görülme sıklığı arasında istatistiksel olarak önemli bir farklılık gözlenmedi (p>0.05). Buna rağmen imidazolin-1 -reseptör (p= 0.200), kinektin (p- 0.144) ve ubikutin spesifik proteaz-28-USP28 (p=0.352) antijenleri normal ve kontroller arasında en farklı olan antijenler olarak bulundu. îstatiksel olarak, belirlenen antijenlerin Behçet hasta alt gruplarındaki dağılımlarına bakıldığında da, antijenlerin gruplar arasındaki dağılımlarında önemli anlamlı bir fark bulunamadı. Tüm antijenler için p değeri > 0.05 olarak bulundu. Belirlenen antijenlerin Behçet hastalığı manifestasyonları arasındaki ilişkiye bakıldığında ise, antijenlerin manifestasyonlar arasında dağılımlarında yine istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamadı. Tüm antijenler için p değeri > 0.05 olarak bulundu. 95Bununla beraber, çalışma grubunun küçüklüğü nedeniyle, tip II istatistik hata olasılığının yüksek olduğu ve buna bağlı olarak gerçekçi değerlendirmenin yapılamadığı kabul edildi. Sonuç olarak, etiyolojisi henüz tam olarak aydınlatılmamış olan Behçet hastalığının temelinde otoimmünitenin gelişebilir bir durum olması ve buna yol açan antikorların saptanabilmesi için bu çalışmamızın, bu konuda yapılan ilk çalışma olması, çalışmanın devamını gerektirmektedir. İleriki çalışmalarımızda, benzer klinik özellik gösteren Behçet hastalığı alt gruplarından oluşturulan spesifik serum havuzunda (örneğin, üveitli hasta grubundan oluşturulacak), farklı bir cDNA ekspresyon kütüphanesinin (örneğin retinal cDNA kütüphanesi) taranması hedeflenmektedir. Behcet's disease is a multisystem inflammatory disorder characterized by recurrent oral ulcers, genital ulcers and ocular inflammation, and which frequently involve the joints, skin, central nervous system (CNS) and gastrointestinal tract The aetiology and pathogenesis of Behcet's disease are still unclear, but there is evidence for genetic, immunologic and infectious factors in the onset and throughout the course of the disease. There is no doubt that an inflammatory response to several autoantigens is found Behcet's disease. Anti-endothelial antibodies, for example, are a frequent but non-specific findings. The retinal S antigen is an interesting candidate autoantigen found mainly in the retina. Other putative autoantigens include heat shock proteins, killer immunoglobulin-like receptors, tropomyosin, co-stimulatory molecules, oxidized low-density lipoprotein and retinal S antigen. However, whether any of these autoantigens are truly pathogenic or whether the immune response directed towards them results from the profound inflammatory reaction associated with disease activation remains unknown. SEREX (serological analysis of recombinant expression of cDNA libaries) is a technique designed to isolate tumor antigens that have elicited high-titer IgG responses in human hosts. This is an immunoscreening method for gene cloning, with two key features that distinguish it from earlier immunoscreenings used to identify targets in autoimmune disease. First, the assay was designed, at last originally, to analyze autologous immunological responses to cancer. Second, the screening is performed with serum samples at high dilution (1:1000-1:100), and the secondary antibody used was specific for human IgG. Several tumor antigens identified by SEREX on various types of cancer and autoimmune diseases. This strategy proved effective to identify disease related autoantigens, in insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM), Systemic lupus erythematosus (SLE), Systemic sclerosis (SSc), Sjogren's Syndrome, giant cell arteritis and polymyalgia rheumatica. In this study, to identify the target autoantigens in Behcet's disease, we made use of an immunoscreening of a amplified human testis cDNA expression library with serum samples obtained from patients with Behcet's disease (n=4) by SEREX 97method. We isolated 20 positive clones. These are: ribosomal protein L3, ubqutin specific protease 29-USP29, imidazolin-1 -receptor, cytochrom B, kinesin light chain, p68 RNA helicase, AKAP450, kinectin, ubiquitin specific protease 28, JK- rekombination protease, EEA1 -early endosome associated Agl, C-NAP1, an image clone, a putative NY-REN37 antigen isoform 2/ nuclear protein Ukp 68, Kinesin-like 8,transcript variantl, Hs trigger transposable element derivation 4 -TIGD4, a clone, weakly similar to peregrine, Ras association domain family4 -RASSF4 and a clone, like KIAA1074. To understand of these identified antigens in patients with Behcet's disease and healty controls, and also to understand their relation with clinical parameters; we screened the antigens in patients (n=31) and controls (n=30) by serologic plaque analysis. We observed that there was no statistically significant difference in the frequency/distribution of defined antigens between the patient and control groups. Similarly, we observed that distribution of these antigens between Behçet patient sub groups did not differ significantly. We think that these results are due to the limited number of the groups studied and also the homogeneous content of the first patient sera pool. Our preliminary study is important for being the first study in this area and for that it targeted autoimmunogenic baseline of Behcet's Disease aetiology which is still unclear. Despite its limitation based on just four patient sera and testis cDNA libary, our preliminary study shows the use of SEREX in Behcet patients autoimmune repertoir. The possibility of success in that kind of study, will give rise to determine the unique antibodies for Behcet's disease, to understand usefulnes of these antibodies in diagnosis and prognosis and also to evaluate the T-cell responses that are possibly present together with these antibodies, all of which will open new doors to understand the pathology of the disease.Key words: Behcet Disease, SEREX, immunogenic antigen 142