Investigation of The Effects of cGAS/STING pathway and PTEN mutations on temozolomide response in glioblastoma cells

Glioblastoma (GBM), tedavi direnci ve nüks ile karakterize, mortalite oranı yüksek primer beyin tümörüdür. Günümüzde GBM tedavisinde cerrahi tedaviyi takiben adjuvan radyoterapi ve temozolomid (TMZ) kullanılmaktadır. Temozolomid ve radyoterapi dirençli rekürrent olgularda alternatif bir tedavi seçeneği bulunmamaktadır. Bu yüzden GBM oluşumu ve tedavi direnci sürecinde işlev gören farklı moleküllerin üzerinden çeşitli mekanizmaların hedeflenmesiyle geliştirilecek yeni tedavilere ihtiyaç vardır. Tümör baskılayıcı genlerden birisi olan PTEN'in, GBM olgularında sıklıkla mutasyona uğradığı ve bu mutasyonların kötü prognoz ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. cGAS/STING, sitoplazmik DNA'yı algılayarak tip-I interferonları (IFN) ve diğer sitokinleri aktive eden ve doğal bağışıklığı tetikleyen sitozolik-DNA'ya duyarlı bir yolaktır. Bu çalışmada, PTEN fonksiyonu bulunan T98G ve PTEN fonksiyonu bulunmayan U118MG hücre hatlarının temozolomid yanıtında cGAS/STING aktivasyonunun belirlenmesini ve STING agonistlerinin (S.A) temozolomid yanıtını arttırmada kullanılabilirliğinin araştırılmasını amaçladık. Bu bağlamda, proliferasyon, sitotoksisite, qRT-PCR, Western Blot ve Elisa analizlerini gerçekleştirdik. T98G hücre hattında SA uygulamasının TMZ'nin sitotoksik etkisini arttırdığı belirledik. Ancak PTEN ifadesi olmayan U118MG hücre hattında SA uygulaması TMZ'nin sitotoksik etkisini değiştirmedi. T98G hücre hattında TMZ ve S.A kombine kullanımının IRF3, STING, NF-ĸB ve RELA ekspresyonlarında anlamlı artışa neden olduğunu belirledik. U118MG hücre hattında elde ettiğimiz sonuçlar ise genel olarak tüm hedef protein düzeylerinin düşük olduğunu, STING proteinin ise hiç ifade edilmediğini gösterdi. IFN-α ve IL-6 düzeylerinin T98G hücre hattında U118MG hücre hattına kıyasla yüksek olduğu, fakat farklı uygulama grupları arasında anlamlı fark olmadığı gözlemlendi. Tüm bu veriler STING agonistinin PTEN aktivitesi ile bağlantılı bir şekilde TMZ yanıtını arttırmada etkili olduğu yönünde kanıtlar sunmakla birlikte, bulgularımızın daha ileri analizler ve in vivo çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir.
Glioblastoma (GBM) is a primary brain tumour with high mortality rate, and it is characterized by treatment resistance and recurrence. Currently following the surgery, adjuvant radiotherapy and temozolomide (TMZ) are commonly used in the treatment of GBM. There is no alternative therapy option in the recurrent cases resistant to TMZ and radiotherapy. Therefore, new therapies are urgently needed to target various mechanisms over different molecules that have function in the progression and treatment resistance of GBM. It has been shown that PTEN, one of the tumour suppressor genes, is frequently mutated in GBM cases and these mutations are associated with poor prognosis. The cGAS/STING is a cytosolic DNA-sensing pathway that senses to the cytoplasmic DNA and activates type-I interferons (IFNs) and other cytokines and triggers innate immunity. In this study we aimed to determine the cGAS/STING activation in the PTEN-harbouring T98G and PTEN-deficient U118MG cell lines in the TMZ response and investigate the usability of STING agonists (S.A) to enhance the effects of TMZ. For this purpose, we performed proliferation, cytotoxicity, qRT-PCR, Western Blot and Elisa analyses. We determined that SA treatment increased the cytotoxic effect of TMZ in the T98G cell line. However, SA exposure did not change the cytotoxic effect of TMZ in the PTEN deficient U118MG cell line. We found that the combined treatment with TMZ and S.A caused a significant increase in IRF3, STING, NF-ĸB and RELA expressions in the T98G cell line. However, our results showed that expressions of all target proteins were lower in the U118MG cell line and STING protein was not expressed at all. It was noticed that IFN-α and IL-6 levels were up regulated in the T98G cell line compared to the U118MG cell line, but there were no significant differences between the treatment groups. Overall, all these data give evidence that the STING agonist can increase the TMZ response depending on the PTEN activity, our findings need to be supported by further analysis and in vivo studies.