Skeletal muscle mass and specific force: effects of genetic background and myostatin dysfunction in response to hypertrophic and atrophic stimuli in mice

Skeletal muscle is an abundant tissue compromising 40–50 % of the body mass in humans (Sakuma et al., 2014). Its main role is to generate force for posture maintenance and performance of daily movements, but it also acts as a metabolically active organ. Muscle mass and function are of particular importance for health and well-being as well as for the athletic performance in sports (Wolfe, 2006). On the contrary, muscle loss is undesired process characterising the consenquence of various diseases and/or catabolic conditions and leads to weakness, frailty and even death (Schiaffino et al., 2013). Thus, investigations of physiological and genetic factors underlying muscle mass and force is crucial for solving and improving health issues of society. Mouse is the most widely used mammalian species in biomedical research. There are several reasons for its popularity. Firstly, analysis of mouse genome has shown that about 99 % of mouse genes have a homolog in the human genome (Guénet, 2005). Secondly, distinct mouse strains show significant variation in phenotypic traits facilitating identification of genes responsible for those traits. Thirdly, contrary to the inbred mice, humans present an outbred population complicating analysis of association between genes and phenotypic traits. Moreover, genetically engineered mice with mutations of specific genes, as in case of myostatin knockout (KO) mice (McPherron et al., 1997), provide a useful tool in identifying functions of those genes. Finally, studies of mice are cost effective due to small body size and relatively short lifespan which is 30 times shorter than in humans (Chang, 2013). Physiological factors that influence the relationship between skeletal muscle mass and force are of large interest. Both these traits to a large extent are determined by genetic factors (Pescatello et al., 2013). Mice of distinct genetic backgrounds (strains) vary substantially in body and skeletal muscle mass (Lionikas et al., 2013a). Large body and skeletal muscle mass in the Berlin High (BEH) and Dummerstorf High (DUH) strains compared to other mouse strains, including a “classic” C57BL/6J strain, is a result of the selective breeding for large body mass and/or carcass protein accretion (Bünger et al., 2004). It is, however, unclear how these enlarged skeletal muscles differ from skeletal muscles of other strains. It is often believed that muscle force is proportional to muscle mass and muscle force per cross-sectional area (CSA) or specific force is a constant value with the exception of pathological conditions as Duchenne muscular dystrophy (Gregorevic et al., 2004). However, this is an oversimplified view. There might be an optimal range of skeletal muscle mass for force production. Beyond this range muscle force might be compromised (Amthor et al., 2007). For instance, changes in an architecture or concentration of contractile proteins in hypertrophied muscles might affect force generation (Degens et al., 2009; Van der Meer et al., 2011; Qaisar et al., 2012). In vivo studies on humans do not allow us to examine these factors comprehensively. Methodological limitations such as difficulties in evaluating the actual muscle mass, influences of neural activation and coactivation of antagonistic muscles complicate assessment of specific muscle force (Erskine et al., 2010). Mouse model permits ex vivo experimentation where skeletal muscle can be isolated and stimulated electrically, thus avoiding most of those issues. Therefore, an identification of mouse strains that differ in specific force could be an important initial step, which would facilitate search for the relevant genetic factors and physiological mechanisms responsible for variation in specific muscle force. Myostatin dysfunction, which was a main focus of this thesis, is the one of the known genetic factors affecting skeletal muscle mass and force. After myostatin discovery by Se-Jin Lee and colleagues it quickly attracted the attention of scientists from various fields including pharmacologists, physiotherapists and even sport scientists (McPherron et al., 1997). Myostatin is a natural inhibitor of muscle growth and protein synthesis. Mice with a deleted function of the myostatin gene (Mstn) display a striking increase in skeletal muscle mass which results a double-muscle phenotype (McPherron et al., 1997). On the other hand, muscle-specific overexpression of myostatin induces a significant reduction in skeletal muscle mass in mice (Reisz-Porszasz et al., 2003). In addition to the prominant muscularity, myostatin-deficient mice show improved bone formation, reduced adiposity as well as increased resistance to weight gain and insulin sensitivity when fed high fat diet (McPherron, Lee, 2002; Hamrick et al., 2006; Wilkes et al., 2009; Elkasrawy, Hamrick, 2010). Altogether, this suggests that myostatin inhibition might be an effective treatment against various muscle wasting conditions including aging-related sarcopenia as well as metabolic dysfunctions such as obesity and diabetes. Indeed myostatin blocking antibodies have a positive effect on muscle mass and function on mdx mice representing a model of Duchenne muscular dystrophy (Bogdanovich et al., 2002; Wagner et al., 2002). There is also some interest in the myostatin inhibition effect on skeletal muscle mass and function of otherwise-normal individuals (e.g. athletes). Large muscles and fast glycolytic fibre profile in myostatin-deficient animals might be beneficial in strength and power events in sports (Girgenrath et al., 2005). Indeed, whippets which are heterozygotes for myostatin mutation are excellent performers in dog races (Mosher et al., 2007). Moreover, the woman who is heterozygous for myostatin mutation and gave birth to the homozygous child is a former sprinter (Schuelke et al., 2004). However, before considering myostatin inhibition as a performance enhancing strategy, more research should be done on physiological effects of myostatin dysfunction using animal models. In fact, studies of myostatin-deficient mice demonstrate that force in isolated skeletal muscles of these animals might be compromised compared to the wild type (WT) animals with the normal myostatin function (Amthor et al., 2007; Qaisar et al., 2012). There is also a gap in knowledge about a plasticity of skeletal muscles in myostatin-deficient animals, because little research has been carried out on adaptability to exercise training of these animals. Several studies examined effect of endurance training on skeletal muscle of myostatin-deficient mice (Savage, McPherron, 2010; Matsakas et al., 2010; Matsakas et al., 2012) but there is a lack of research about adaptations to high resistance training. Thus we carried out a study on compensatory hypertrophy of skeletal muscles in myostatin-deficient animals. Indeed athletes involved in strength training but not endurance training might be those who could benefit from myostatin inhibition. It is well established that an increase of myostatin expression is a key factor in every type of skeletal muscle atrophy examined to date (Allen et al., 2010). Most of the studies are focused on myostatin inhibition in pathological conditions such as Duchenne muscular dystrophy (Bogdanovich et al., 2002; Wagner et al., 2002). However, the otherwise normal individuals might be subjected to catabolic stimuli as well. For instance, they might undergo skeletal muscle wasting either involuntary due to starvation, bed rest and/or space flight (Hegarty, Kim, 1981; Fitts et al., 2010; Sandonà et al., 2012). Various dietary regimes often involve intermittent fasting which reduces lean body mass (Varady, 2011). Thus, muscle wasting can be a result of conscious manipulations involving caloric restriction in order to achieve cosmetic goals which are associated with body shape and appearance. However, caloric restriction is also associated with improved health and longevity biomarkers in rodents and humans (Heilbronn et al., 2006; Ingram et al., 2006). It seems that caloric restriction will be popular in near future as new dietary interventions are being developed (Varady et al., 2015). In this scenario myostatin inhibition might be a useful strategy to preserve skeletal muscle mass during caloric restriction. Moreover, myostatin inhibition is a promising target for an enhanced fat loss as well (McPherron, Lee, 2002). To date, few attempts have been made to investigate effects of myostatin deficiency on skeletal muscle mass after food deprivation (FD) (Allen et al., 2010; Collins-Hooper et al., 2015). These studies have produced contradictory results and more research is needed. Effects of FD on contractile properties of skeletal muscle also need to be examined in this regard. It appears that FD causes reduction in muscle mass which is associated with an increase in specific force of fast-twitch skeletal muscles of myostatin-deficient mice (Collins-Hooper et al., 2015). Similar findings have been reported after 5 week caloric restriction study (Matsakas et al., 2013). Based on these evidences, we carried out a study in which we examined effects of myostatin dysfunction on skeletal muscle mass and force in both predominantly slow-twitch and fast-twitch muscles following FD. Slow- and fast-twitch muscles are showing different metabolic and functional properties as well as a content of myostatin-binding ActRIIB receptors (Mendias et al., 2006). Therefore effects of myostatin dysfunction and FD might be muscle specific. Moreover, we also examined how a genetic background affects these parameters following FD. THE AIM OF THE RESEARCH was to examine effects of genetic background and myostatin dysfunction on specific force and mass of skeletal muscles after muscle hypertrophy and atrophy. RESEARCH OBJECTIVES: 1. To investigate effects of genetic background on skeletal muscle mass and force. 2. To investigate effects of myostatin dysfunction on skeletal muscle mass and force before and after functional overload. 3. To investigate effects of myostatin dysfunction and genetic background on skeletal muscle atrophy and muscle force during food deprivation. RESEARCH HYPOTHESES: 1. We studied skeletal muscles in mouse strains which differ significantly in body size. On the basis that larger muscle hypertrophy might lead to unfavourable for force production changes in muscle architecture and/or contractile material maintainence (Kawakami et al., 1995; Amthor et al., 2007; Ikegawa et al., 2008), our hypothesis was that specific muscle force will be dependent on muscle size and it will decrease with increase in body and muscles mass of the studied mouse strains. 2. Myostatin-deficient mice have increased glycolytic type II fibre content in muscles (Girgenrath et al., 2005; Gentry et al., 2011) which are more prone to hypertrophy (Verdijk et al., 2009). It appears that only muscle mass reduction toward wild type phenotype could restore force production in myostatin-deficient mice (Matsakas et al., 2013; Collins-Hooper et al., 2015). Thus, we hypothesized that ablation of the gastrocnemius muscle will be associated with greater compensatory hypertrophy of soleus and its function deterioration in BEH mice with dysfunctional myostatin compared to BEH+/+ mice carrying the wild type myostatin. 3. We studied mass and force of the hindlimb muscles in BEH and BEH+/+ mice as well as in the C57BL/6J background. Our hypothesis was that myostatin dysfunction which positively affects a net muscle protein turnover by enhanced protein synthesis (Morrisete et al., 2009; Lipina et al., 2010) will prevent loss of muscle mass and improve force during food deprivation. We also hypothesized that there might be differences in loss of muscle mass between genetic backgrounds due to possible changes in a body composition and/or metabolic peculiarities (Konarzewski, Diamond, 1995). CONCLUSIONS Study 1: 1. Skeletal muscles of mouse strains vary significantly in muscle mass and force generation capacity. Specific muscle force, however, does not change with increase in body size and as a result of muscle growth during maturation. 2. DUH background shows lower specific muscle force compared to both BEH+/+ and C57BL/6J backgrounds. Study 2: 1. Myostatin dysfunction is associated with increased muscle mass, but reduced specific muscle force. 2. Myostatin dysfunction is also associated with reduction in hypertrophy and impairment in force generation capacity of soleus muscle after functional overload. Study 3: 1. Skeletal muscle atrophy after food deprivation is dependant on myostatin dysfunction, genetic background and muscle properties. Myostatin dysfunction is associated with a greater loss of muscle mass. C57BL/6J background is more susceptible to muscle atrophy than BEH+/+ background under these conditions. 2. After food deprivation, the slower contracting soleus shows less severe muscle atrophy, but greater loss of specific muscle force compared to a faster contracting extensor digitorum longus.
Griaučių raumenys yra gausus audinys, sudarantis 40–50 proc. žmogaus kūno masės (Sakuma et al., 2014). Pagrindinis jų vaidmuo –išvystyti jėgą, reikalingą laikysenai palaikyti ir kasdieniams judesiams atlikti, tačiau jie taip pat veikia ir kaip metaboliškai aktyvus organas. Raumenų masė ir funkcija yra svarbios ne tik sveikatai ir gerai savijautai, bet ir atletiniam pajėgumui (Wolfe, 2006). Raumenų netekimas yra nepageidautinas procesas, būdingas įvairioms ligoms ir (arba) katabolinėms būsenoms, veda prie silpnumo, trapumo ar netgi mirties (Schiaffino et al., 2013). Todėl fiziologinių ir genetinių veiksnių, lemiančių raumeninę masę, jėgą ir jų tarpusavio ryšį, tyrimai yra svarbūs, gerinant visuomenės sveikatą. Raumenų masė ir jėga labai priklauso nuo genetinių veiksnių (Pescatello et al., 2013). Skirtingų genetinių fonų (linijų) pelės labai skiriasi kūno ir griaučių raumenų mase (Lionikas et al., 2013a). Didelė Berlyno (angl. Berlin high; BEH) ir Dumerstorfo (angl. Dummerstorf high; DUH) linijų kūno ir griaučių raumenų masė, lyginant su kitomis linijomis, įskaitant klasikinę C57BL/6J, yra selektyvaus veisimo didelei kūno masei ir (arba) karkasinių baltymų susikaupimui rezultatas (Bünger et al., 2004). Tačiau neaišku, kaip šie padidinti griaučių raumenys skiriasi nuo kitų pelių linijų raumenų. Dažnai manoma, kad raumens jėga yra proporcinga raumens masei ar skerspjūvio plotui (angl. cross-sectional area; CSA), todėl vadinamoji specifinė jėga yra gana pastovus dydis, išskyrus patalogines būsenas, tokias kaip Diušeno raumenų distrofija (Gregorevic et al., 2004). Vis dėlto, tai yra supaprastintas požiūris. Gali egzistuoti optimalus jėgos išvystymui griaučių raumenų masės dydis, kurį peržengus raumenų jėga suprastėtų (Amthor et al., 2007). Pavyzdžiui, architektūriniai ar kontraktilinių baltymų koncentracijos pokyčiai hipertrofuotuose raumenyse gali paveikti jėgos išvystymą (Degens et al., 2009; Van der Meer et al., 2011; Qaisar et al., 2012). In vivo tyrimai su žmonėmis neleidžia išsamiai panagrinėti šių veiksnių. Tokie metodologiniai trūkumai, kaip faktinės raumeninės masės įvertinimo sunkumas, nervinės aktyvacijos įtaka ir raumenų antagonistų koaktyvacija, sunkina specifinės raumenų jėgos nustatymą (Erskine et al., 2010). Pelės modelis leidžia ex vivo bandymus, kurių metu griaučių raumenys gali būti izoliuojami ir stimuliuojami elektra, taip išvengiant daugumos išvardytų problemų. Todėl pelių linijų, besiskiriančių specifine jėga, nustatymas galėtų būti svarbus žingsnis, palengvinantis svarbių genetinių veiksnių ir fiziologinių mechanizmų, atsakingų už specifinės raumenų jėgos variaciją, paiešką. Miostatino disfunkcija, kuriai šiame darbe buvo skiriamas pagrindinis dėmesys, yra vienas iš žinomų genetinių veiksnių, veikiančių griaučių raumenų masę ir jėgą. Po to, kai Se-Jin Lee su kolegomis atrado miostatiną, jis greitai patraukė įvairių sričių mokslininkų dėmesį – farmacininkų, fizioterapeutų ir netgi sporto mokslo tyrėjų (McPherron et al., 1997). Miostatinas yra natūralus raumenų augimo ir baltymų sintezės slopintojas. Pelių, kurioms panaikinta miostatino geno (Mstn) funkcija, būdingas įspūdingas griaučių raumenų masės padidėjimas, kuris lemia vadinamąjį dvigubo raumeningumo fenotipą (McPherron et al., 1997). Ir priešingai, raumenims būdingas miostatino aktyvacijos padidėjimas sukelia reikšmingą pelių griaučių raumenų masės sumažėjimą (Reisz-Porszasz et al., 2003). Be akivaizdaus raumeningumo, miostatino stokojančios pelės taip pat pasižymi pagerėjusiu kaulų formavimusi, sumažėjusiu riebaliniu audiniu, padidėjusiu atsparumu svorio augimui ir dideliu insulino jautrumu, kai joms buvo skirta riebi dieta (McPherron, Lee, 2002; Hamrick et al., 2006; Wilkes et al., 2009; Elkasrawy, Hamrick, 2010). Tai rodo, kad miostatino slopinimas gali būti veiksmingas įvairių ligų, tokių kaip įvairus raumenų nykimas, įskaitant su senėjimu susijusią sarkopeniją, metabolinės disfunkcijos (nutukimas, diabetas), gydymo būdas. Miostatiną blokuojantys antikūnai turi teigiamą poveikį mdx pelių, kurios yra Diušeno raumenų distrofijos modelis, raumenų masei ir funkcijai (Bogdanovich et al., 2002; Wagner et al., 2002). Taip pat yra domimasi miostatino slopinimo poveikiu sveikų individų griaučių raumenų masei ir funkcijai (pvz., sportininkams ar individams, kuriems būdingos katabolinės būsenos). Miostatino stokojančių pelių tyrimai rodo, kad šių gyvūnų specifinė raumenų jėga gali būti suprastėjusi, lyginant su laukiniais gyvūnais (angl. wild type; WT), kurių miostatino funkcija normali (Amthor et al., 2007; Qaisar et al., 2012). Be to, trūksta žinių apie sveikų gyvūnų, stokojančių miostatino, griaučių raumenų plastiškumą, nes buvo atlikta labai mažai tyrimų apie šių gyvūnų adaptaciją prie fizinių krūvių. Keletas tyrimų nagrinėjo ištvermės treniruočių poveikį miostatino stokojančių pelių griaučių raumenims (Savage, McPherron, 2010; Matsakas et al., 2010; Matsakas et al., 2012), bet nėra tyrimų, nagrinėjančių adaptacijos poveikį pasipriešinimo treniruotėms (hipertrofiniam stimului). Todėl mes tyrėme griaučių raumenų kompensatorinės hipertrofijos poveikį miostatino stokojančių pelių raumenų masei ir jėgai. Iš tikrųjų jėgos, bet ne ištvermės, šakų sportininkais galėtų būti tie, kurie pajustų miostatino slopinimo naudą. Taip pat neaišku, ar miostatino slopinimas galėtų apsaugoti sveikų individų, patiriančių katabolines būsenas, raumeninę masę ir jėgą. Tam yra aiškių prielaidų, nes miostatino stoka teigiamai veikia pelių raumenų baltymų sintezę (Morrisete et al., 2009; Lipina et al., 2010), o padidėjusi miostatino ekspresija būdinga įvairioms griaučių raumenų atrofijoms (Allen et al., 2010). Sveiki individai gali sąmoningai netekti raumenų dėl kalorijų apribojimo, siekdami kosmetinių tikslų, susijusių su kūno forma ir išvaizda, ar priverstinai dėl maisto stygiaus ar netgi badavimo. Iki šiol buvo tik keli mėginimai ištirti miostatino stokos poveikį griaučių raumenų masei ir jėgai badavimo metu (Allen et al., 2010; Collins-Hooper et al., 2015), buvo gauti prieštaraujantys vieni kitiems rezultatai. TYRIMO TIKSLAS buvo ištirti genetinio fono ir miostatino disfunkcijos poveikį griaučių raumenų masei ir specifinei jėgai, esant hipertrofijos ir atrofijos stimulams. TYRIMO UŽDAVINIAI: 1. Ištirti genetinio fono poveikį griaučių raumenų masei ir jėgai. 2. Ištirti miostatino disfunkcijos poveikį griaučių raumenų masei ir jėgai prieš funkcinę apkrovą ir po jos. 3. Ištirti miostatino disfunkcijos ir genetinio fono poveikį griaučių raumenų masei ir jėgai badavimo metu. TYRIMO HIPOTEZĖS: 1. Mes tyrėme pelių linijų, kurios labai skiriasi kūno dydžiu, raumenis. Remdamiesi tuo, kad didesnė raumenų hipertrofija gali sukelti jėgos išvystymui nepalankius raumenų architektūros ir (arba) kontraktilinio aparato palaikymo pokyčius (Kawakami et al., 1995; Amthor et al., 2007; Ikegawa et al., 2008), kėlėme hipotezę, kad raumens specifinė jėga priklauso nuo raumens dydžio ir mažės didėjant pelių kūno ir raumenų masei. 2. Miostatino stokojančių pelių yra padidėjęs II tipo skaidulų kiekis raumenyse (Girgenrath et al., 2005; Gentry et al., 2011), jos labiau linkusios hipertrofuoti (Verdijk et al., 2009). Atrodo, kad tik raumeninės masės sumažėjimas link fenotipo, būdingo laukinėms pelėms, galėtų atgauti pelių, stokojančių miostatino, jėgos išvystymą (Matsakas et al., 2013; Collins-Hooper et al., 2015). Mūsų hipotezė – BEH pelių su miostatino disfunkcija blauzdos dvilypio raumens pašalinimas bus susijęs su didesne plekšninio raumens kompensatorine hipertrofija ir jo funkcijos pablogėjimu labiau nei BEH+/+ pelių, kurių miostatinas normalus. 3. Tyrėme BEH ir BEH+/+ pelių bei C57BL/6J genetinio fono užpakalinių kojų raumenų masę ir jėgą. Mūsų hipotezė buvo, kad miostatino disfunkcija, teigiamai veikianti bendrą raumenų baltymų balansą, didindama baltymų sintezę (Morrisete et al., 2009; Lipina et al., 2010), apsaugos nuo raumeninės masės netekimo ir pagerins jėgos išvystymą po badavimo. Mes taip pat iškėlėme hipotezę, kad raumeninės masės netekimo skirtumai tarp genetinių fonų gali būti dėl galimų kūno kompozicijos pokyčių ir (arba) metabolinių ypatumų (Konarzewski, Diamond, 1995). IŠVADOS 1 tyrimas: 1. Skirtingų pelių linijų griaučių raumenys labai skiriasi savo mase ir jėgos išvystymo pajėgumu. Vis dėlto, specifinė raumenų jėga nekinta didėjant kūno dydžiui ir raumenims augant brendimo metu. 2. DUH genetinis fonas rodo mažesnę raumenų specifinę jėgą, lyginant su BEH+/+ ir C57BL/6J genetiniais fonais. 2 tyrimas: 1. Miostatino disfunkcija yra susijusi su padidėjusia raumenine mase, bet sumažėjusia raumenų specifine jėga. 2. Miostatino disfunkcija taip pat yra susijusi su plekšninio raumens hipertrofijos sumažėjimu ir jėgos išvystymo pajėgumo blogėjimu po funkcinės apkrovos. 3 tyrimas: 1. Griaučių raumenų atrofija po badavimo priklauso nuo miostatino disfunkcijos, genetinio fono ir raumenų savybių. Miostatino disfunkcija yra susijusi su didesniu raumeninės masės praradimu, o C57BL/6J genetinis fonas yra jautresnis raumenų atrofijai nei BEH+/+ genetinis fonas tokiomis pat sąlygomis.