Optimizacija uslova ekstrakcije i kvantifikacija tropomiozina dagnji ELISA testom

Tropomiozini su visoko očuvani kontraktilni proteini kod kičmenjaka i beskičmenjaka, molekulske mase od oko 35-38 kDa. Uprkos njihovoj relativno maloj zastupljenosti, kod porodice beskičmenjaka prepoznati su kao pan-alergeni. Prema statistici tropomiozini su treći najčešći uzrok anafilakse izazvane hranom. U ovom radu ispitani su uslovi optimalne ekstrakcije proteina sirovih i kuvanih dagnji. Krajnji cilj je bila kvantifikacija tropomiozina u dobijenim ekstraktima sirovih i kuvanih dagnji, razvijanjem i optimizacijom uslova ELISA testa. Za potrebe optimizacije uslova ekstrakcije korišćeno je nekoliko pufera različitih pH vrednosti i jonske sile, kao i različito vreme ekstrakcije (2 h i 24 h). Kao model organizam izabrana je mediteranska dagnja. Kvantifikacija proteina u ekstraktima urađena je Bredfordovom metodom, proteinski profili ekstrakata vizualizovani su pomoću natrijum-dodecilsulfat poliakrilamidne gel elektroforeze (SDS-PAGE), a potom je potvrđeno prisustvo tropomiozina Western blotom sa monoklonskim i poliklonskim antitelima. Nakon optimizacije ELISA testa urađena je kvantifikacija tropomiozina u dobijenim ekstraktima. Prema dobijenim rezultatima, nije primećena statistički značajna razlika u koncentracijama proteina u ekstraktima dobijenim nakon 2 h i 24 h. Ekstrakcija proteina dagnji pokazala se efikasnijom sa porastom pH pufera. Vrednosti koncentracija proteina u ekstraktima sirovih i kuvanih dagnji, dobijene Bredfordovom metodom, u skladu su sa elektroforetskim profilima ekstrakata. Denzitometrijom, sa gela kuvanih uzoraka nakon SDS-PAGE, procenjene su bile koncentracije tropomiozina. Western blotom, odrađenim nakon SDS-PAGE, potvrđeno je prisustvo tropomiozina. Pokazano je da tropomiozin kuvanih ekstrakata daje jači signal od tropomiozina iz sirovih solubilnih ekstrakata dagnji. Radi kvantifikacije tropomiozina razvijen je sendvič ELISA test i izračunati su limit detekcije i limit kvantifikacije testa. Koncentracije tropomiozina u ekstraktima dobijene pomoću ELISA testa bile su za tri reda veličine niže od koncentracija procenjenih denzitometrijom, što pokazuje da se razvijeni ELISA test, kao takav, iako specifičan, ne može koristiti za pouzdanu i preciznu kvantifikaciju tropomiozina dagnji. Kao dobro rešenje, za prevazilaženje ovih ograničenja koja se javljaju kod ELISA testa, pokazala se kvantifikacija Western blotom.