Génération d'une plateforme protéomique de traitement haut débit pour l'identification et la caractérisation des VHH recombinants contre CD105

Screening of a VHH cDNA library raised from alpacas immunised with a lysate of T24 cells (human urine bladder cancer cell line over-expressing CD105), with soluble CD105 by phage display and phage ELISA resulted in 19 VHHs that bind to human CD105 protein, an endothelial co-receptor of TFG-β involved in the regulation of angiogenesis and tumour development. The selected anti-CD105 VHH cDNAs were amplified, sequenced and analysed with ExPASY, GeneDoc and BLAST tools. The nineteen sequences showed the typical structural features of a VHH and all of them were different. The VHH cDNAs were subcloned from the phagemid vector pHEN2 into pET22b(+) vector for expression and purification of recombinant VHH proteins by affinity chromatography on Ni-NTA agarose columns. Thirteen recombinant VHH proteins maintained the ability to bind CD105 as determined by ELISA. These anti-CD105 VHHs were microarrayed on biochips to evaluate their specificity and affinity to CD105 membrane-bound on cells by Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi). SPRi data showed that the recombinant VHHs bind SC cells that overexpress CD105 on their surface but not or little THP-1 cells that do not, proving their specificity. The average of SPRi reflectivity variation among the 13 VHHs at 2 hours of assays was 4.59 with SC cells and 2.69 with the THP-1 cells, cell density average was 578 cells/area with SC cells and 367 cells/area with THP-1 cells and the average of the approximation to the apparent affinity constant was 110.19 x 10-2 with SC cells and 106.26 x 10-2 with THP-1 cells. The VHH were grouped according to their specificity and affinity approximation, six had high specificity and affinity approximation (3 of them even higher than the positive control), five were specific but had low affinity approximation and two had low specificity and affinity approximation. The most efficient (six top-ranked) anti-CD105 VHHs, that bind with high affinity and specificity to CD105 in solution (sCD105) and on cells (membrane-bound CD105), are proposed as CD105detection tools for research both in studies that seek a better understanding of the CD105 function in vitro and in vivo and in application as nanoprobes for the diagnosis and therapeutics of diseases in which angiogenesis plays an important role.; Le criblage d'une bibliothèque d'ADNc de VHH provenant d'alpagas immunisés avec un lysat de cellules T24 (lignée cellulaire de cancer de la vessie humaine surexprimant CD105), avec CD105 soluble par l'exposition sur phage (phage display) et phage-ELISA a permis de trouver 19 VHH qui se lient à la protéine CD105 humaine, un co-récepteur endothélial de TFG-β impliqué dans la régulation de l'angiogenèse et du développement tumoral. Les ADNc des VHH anti-CD105 sélectionnés ont été amplifiés, séquencés et analysés avec les outils ExPASY, GeneDoc et BLAST. Les dix-neuf séquences présentaient les caractéristiques structurelles typiques d'un VHH et toutes étaient différentes. Les ADNc de VHH ont été sous-clonés du vecteur phagemid pHEN2 dans le vecteur pET22b(+) pour l'expression et la purification des protéines VHH recombinantes par chromatographie d'affinité sur des colonnes d'agarose Ni-NTA. Treize protéines VHH recombinantes ont conservé la capacité de lier CD105 comme déterminé par ELISA. Ces VHH anti-CD105 ont été immobilisés sur des biopuces afin d'évaluer leur spécificité et leur affinité avec le CD105 lié à la membrane des cellules par imagerie de la résonance des plasmons de surface (SPRi). Les données SPRi ont montré que les VHH recombinants se lient aux cellules SC qui surexpriment CD105 à leur surface mais pas ou peu aux cellules THP-1 qui ne le font pas, prouvant ainsi leur spécificité. La moyenne de la variation de la réflectivité SPRi parmi les 13 VHHs à 2 heures d'essais était de 4,59 avec les cellules SC et de 2,69 avec les cellules THP-1, la moyenne de la densité cellulaire était de 578 cellules/superficie de référence avec les cellules SC et de 367 cellules/superficie de référence avec les cellules THP-1 et la moyenne de l'approximation de la constante d'affinité apparente était de 110,19 x 10-2 avec les cellules SC et de 106,26 x 10-2 avec les cellules THP-1. Les VHH ont été répartis en groupes en fonction de leur spécificité et de leur approximation d'affinité. Six avaient une spécificité et une approximation d'affinité élevées (trois encore plus que le contrôle positif), cinq étaient spécifiques mais avaient une approximation d'affinité faible et deux avaient une spécificité et une approximation d'affinité faibles. Les VHH anti-CD105, les plus efficaces (les six mieux classés) qui se lient avec une affinité et une spécificité élevées au CD105 en solution (sCD105) et sur les cellules (CD105 lié à la membrane), ont été proposés comme outils de détection du CD105 pour la recherche à la fois dans les études qui cherchent à mieux comprendre la fonction du CD105 in vitro et in vivo et dans l'application comme nano-sondes pour le diagnostic et la thérapeutique des maladies dans lesquelles l'angiogenèse joue un rôle important.