Utilisation des lasers à électrons libre pour étudier les protéines photosensibles par cristallographie résolue en temps

X-ray free-electron lasers (XFELs) are large-scale facilities that produce highly brilliant and short X-ray pulses. XFELs, complementing synchrotrons, allow the determination of the structure of fragile proteins to be solved from small microcrystals and their dynamics to be examined with femtosecond time resolution using a suite of techniques known as serial femtosecond crystallography (SFX). The goal of this Ph.D. work was to examine short-lived intermediates ranging from pico- to microseconds in two light-sensitive proteins using time- resolved SFX (TR-SFX) at XFELs. The two systems that have been studied were a photoenzyme, named fatty acid photodecarboxylase (FAP), and a reversible photoswitchable fluorescent protein (RSFP), named rsEGFP2.FAP is one of the three enzymes discovered so far, whose catalytic activity requires a continuous flux of light. FAP, which harbors a FAD cofactor, is involved in the metabolism of lipids in microalgae and catalyzes the decarboxylation of free fatty acids to alkanes or alkenes in response to blue light. We have been able to solve the radiation damage-free SFX structure of FAP's resting state at 2 Å resolution that confirmed the observation made in a high-resolution cryo-MX structure that unusual bending of the isoalloxazine ring of the FAD is present in the oxidized starting state. Furthermore, our TR-SFX study made it possible to follow light-induced decarboxylation in real-time. A detailed description of data analysis of TR-SFX data on FAP as well as structure factor extrapolation of the intermediate states is presented.RSFPs and thus rsEGFP2 are essential tools in advanced fluorescence microscopy of live cells. They can be repeatedly toggled back and forth between a fluorescent (on) and a non-fluorescent (off) state by irradiation with light at two different wavelengths. Based on the reaction intermediates determined by TR-SFX on parental rsEGFP2 determined on the pico- to nanosecond time scale, two rationally designed variants of rsEGFP2 have been generated. In this thesis, off-state structures of the variants were solved by SFX. Furthermore, nanosecond TR-SFX experiments on these rsEGFP2 variants were carried out that provide insight into modified energy landscapes. Nanosecond TR-SFX intermediate structures on rsEGFP2 variants were described and a systematic comparison of rsEGFP2 SFX and SSX data to prepare for millisecond TR synchrotron serial crystallography (SSX) experiments on rsEGFP2 in the near future.; Les lasers X à électrons libres (XFELs) sont des installations à grande échelle qui produisent des impulsions de rayons X très brillantes et courtes. Les XFELs, complémentaires des synchrotrons, permettent de déterminer la structure des protéines fragiles à partir de petits microcristaux et d'examiner leur dynamique avec une résolution temporelle femtoseconde à l'aide d'une suite de techniques connues sous le nom de cristallographie sérielle femtoseconde (SFX). Le but de ce doctorat consistait à examiner les intermédiaires de courte durée allant de la pico- à la microseconde dans deux protéines sensibles à la lumière en utilisant la SFX résolu en temps (TR-SFX) aux XFELs. Les deux systèmes qui ont été étudiés étaient une photoenzyme, appelée photodécarboxylase d'acide gras (FAP) et une protéine fluorescente photocommutable réversible (RSFPs), appelée rsEGFP2.La FAP est l'une des trois enzymes découvertes à ce jour, dont l'activité catalytique nécessite un flux continu de lumière. La FAP, qui abrite un cofacteur FAD, est impliquée dans le métabolisme des lipides dans les microalgues et catalyse la décarboxylation des acides gras libres en alcanes ou alcènes en réponse à la lumière bleue. Nous avons été en mesure de résoudre la structure SFX sans dommage par des rayons X de l'état "off" de la FAP à une résolution de 2 Å qui a confirmé l'observation faite dans une structure cryo-MX à haute résolution selon laquelle une flexion inhabituelle de l'anneau isoalloxazine du FAD est présente dans l'état oxydé. Notre étude TR-SFX a ensuite permis de suivre en temps réel la décarboxylation induite par la lumière. Une description détaillée de l'analyse des données TR-SFX sur FAP ainsi que l'extrapolation du facteur de structure des états intermédiaires est présentée.Les RSFPs et donc rsEGFP2 sont des outils essentiels dans la nanoscopie de fluorescence avancée des cellules vivantes. Elles peuvent être basculées à plusieurs reprises entre un état fluorescent (on) et un état non fluorescent (off) par irradiation avec de la lumière à deux longueurs d'onde différentes. Basé sur les structures intermédiaires de réaction déterminées par TR-SFX sur rsEGFP2 parental déterminées à l'échelle de temps pico- à nanoseconde, deux variants rationnellement conçus du rsEGFP2 ont été générés. Dans cette thèse, les structures "off" des variants ont été résolues par SFX. De plus, des expériences TR-SFX nanosecondes sur ces variants de rsEGFP2 ont été menées. Des structures intermédiaires nanosecondes TR-SFX sur des variants de rsEGFP2 ont été décrites et une comparaison systématique de données SFX et SSX a été effectuée, en vue d'expériences résolues en temps au synchrotron (TR-SSX).