Biophysical studies applied in mapping the interaction between biologically active compounds and macromolecules

The understanding of action mechanism from molecules that bind to proteins, nucleic acids, carbohydrates, among others, is of the utmost importance since these biomolecules are involved in most cellular functions and the comprehension of their molecular target contribute to the development of new drugs. The aim of this work was to evaluate the interaction of different bioactive compounds with human hemoglobin (Hb) and ctDNA (Calf thymus) using spectroscopic techniques, electrophoresis and theoretical studies, which allowed investigate the binding magnitude of the complexes formed with protein and DNA. Thus, according to the results obtained it was observed that the pterocarpane derivative (LQB-223) formed a non-fluorescent supramolecular complex characterized by the static quenching mechanism and the binding constant (Kb) obtained was 1.94103 L mol-1 (30 °C), the hydrophobic interactions being responsible for stabilizing the complexes formed in this process. The binding mode was characterized by groove and by the electrophoresis assay, it was found that there was no DNA fragmentation. For the piperidine derivatives, it was observed that interaction occurs preferentially by static quenching, via intercalation, where Kb values ranged from 0.10 to 8.00104 L mol-1. By correlating the values of the binding constants with the biological activity data (GI50), it was observed that the correlation coefficients varied in the range of 0.8174  r  0.9868, for HT29, NCI-H460, 786-0 and NCI / ADR-RES, suggesting that the main mechanism of action of these compounds may be associated with DNA as a biological target. For the interaction studies between hemoglobin and thimerosal (TH), it was verified that the ligand interacts with the macromolecule by static quenching and binding constant about 106 L mol-1 and the main forces that govern this process are the electrostatics. The TH: Hb stoichiometry was 2:1, suggesting that ethyl mercury binding of thimerosal occurs in the two available cysteine residues (βCys93) present in the β subunit. These data are consistent with the results obtained by the NEM reagent (thiol group blocker) assay, where a decrease in Kb values was observed in the presence of increasing amounts of this reagent. In addition, it was found that conformational changes occur in the protein structure after complexation with the evaluated ligand being confirmed by the DLS and electrophoresis assays. In the competing species evaluation, it was observed that Ca(II) and Mg(II) were the ions that exerted the greatest influence on the interaction process. As consequence, inhibition of Hb-O2 binding capacity up to 72% (human Hb), and 50% (human erythrocytes), was verified. Dose-dependent induction of TH forming advanced glycation end products (AGE) and protein aggregates (amyloids) was additionally observed. Finally, these results highlight the toxic potential of the use of TH in biological systems, with a consequent risk to human health. CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O entendimento do mecanismo de ação de moléculas que se ligam a proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, entre outras, é de suma importância uma vez que essas biomoléculas estão envolvidas na maioria das funções celulares e a compreensão dos seus mecanismos moleculares de ação contribuem para o desenvolvimento de novos medicamentos. Desta forma, esse trabalho teve como objetivo avaliar a interação de diferentes compostos bioativos com a hemoglobina humana (Hb) e ctDNA (Calf thymus), utilizando técnicas espectroscópicas, eletroforese e estudos teóricos, que permitiram investigar a magnitude de ligação dos complexos formados com a proteína e DNA. Assim, de acordo com os resultados obtidos pôde-se observar que o derivado pterocarpano (LQB-223) formou um complexo supramolecular não fluorescente, caracterizado pelo mecanismo de quenching estático e a constante de ligação (Kb) obtida foi de 1,94103 L mol-1 (30 °C), sendo as interações hidrofóbicas, as responsáveis por estabilizar os complexos formados nesse processo. O modo de ligação preferencial foi caracterizado via groove e pelo ensaio de eletroforese verificou-se que não houve fragmentação do DNA. Para os derivados piperidínicos, observou-se que ocorre interação preferencialmente por quenching estático, via intercalação, onde os valores de Kb variaram de 0,10 a 8,00104 L mol-1. Por meio da correlação dos valores das constantes de ligação com os dados de atividade biológica (GI50), pôde-se observar que os coeficientes de correlação variaram na faixa de 0,8174  r  0,9868, para as linhagens HT29, NCI-H460, 786-0 e NCI/ADR-RES, sugerindo que o principal mecanismo de ação desses compostos pode estar associado ao DNA como alvo biológico. Para os estudos de interação entre a hemoglobina e o timerosal (TH), verificou-se que o ligante interage com a macromolécula por quenching estático e constante de ligação na ordem de 106 L mol-1 e as principais forças que regem esse processo de interação são as eletrostáticas. A estequiometria TH:Hb foi de 2:1, sugerindo que ocorre ligação do etilmercúrio do timerosal nos dois resíduos de cisteína disponíveis (βCis93) presentes na subunidade β. Esses dados são concordantes com os resultados obtidos pelo ensaio com o reagente NEM (bloqueador de grupo tiol), onde verificou-se diminuição nos valores de Kb na presença de quantidades crescentes deste reagente. Além disso, constatou-se que ocorrem mudanças conformacionais na estrutura da proteína após complexação com o ligante avaliado sendo confirmado pelos ensaios de DLS e eletroforese. Na avaliação de espécies competidoras, observou-se que o Ca(II) e Mg(II) foram os íons que exerceram maior influência no processo de interação. Como consequência, verificou-se inibição da capacidade de ligação de Hb-O2 até 72% (Hb humana) e 50% (eritrócitos humanos). Também foi observada a indução de produtos finais de glicação avançada (AGE) e agregados de proteína (amilóides) dependente da dose de TH. Por fim, esses resultados destacam o potencial tóxico do uso de TH em sistemas biológicos, com consequente risco à saúde humana.