Effects of rapamycin in canine primary and metastatic mammary tumor cells cultivated in vitro

Submitted by Patrícia de Faria Lainetti (patricia.lainetti@unesp.br) on 2019-08-23T14:39:10Z No. of bitstreams: 1 DEFESA enviado pós-graduação2.pdf: 10947640 bytes, checksum: e6809abf0e21d93847c75844a7512472 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2019-08-23T17:21:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lainetti_pf_me_bot_par.pdf: 1875357 bytes, checksum: a77d5e0cc123f345186f40a7671584fc (MD5) Made available in DSpace on 2019-08-23T17:21:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lainetti_pf_me_bot_par.pdf: 1875357 bytes, checksum: a77d5e0cc123f345186f40a7671584fc (MD5) Previous issue date: 2019-06-27 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) As neoplasias estão se tornando cada vez mais comuns entre os animas domésticos, seja devido a maior expectativa de vida ou pelo avanço dos métodos diagnósticos e tratamentos. As neoplasias mamárias são o tipo mais comum de neoplasias entre as fêmeas caninas. A procura por novos tratamentos e/ou tratamentos específicos para os animais é cada vez mais comum frente à esse quadro. A rapamicina é um fármaco antifúngico com atividade antitumoral, que atua inibindo o complexo mTOR, já testada para o tratamento de neoplasias em diferentes órgãos em humanos, podendo ser uma alternativa no tratamento de neoplasias em cães. Devido ao grande número de repetições que os ensaios com fármacos necessitam, o cultivo celular in vitro é uma alternativa inicial para a descoberta de novos medicamentos eficazes no tratamento dessa espécie, além de também se tornar um ensaio pré-clínico. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da rapamicina em células de tumores mamários primários e suas respectivas metástases de cadelas, cultivadas in vitro. Foram utilizados dois tipos histológicos tumores de mama, provenientes do tumor primário e suas respectivas metástases. Após a colheita, as amostras foram classificadas por histopatologia como carcinoma sólido grau III e carcinoma adenoescamoso, como tumores triplo negativos não basal pela imuno-histoquímica e tanto os tumores primários como suas metástases apresentaram expressão positiva para as proteínas PTEN, AKT, mTOR e 4EBP1 na imunofluorescência. Parte do tecido tumoral foi cultivado in vitro e as células foram avaliadas quanto a morfologia e fenótipo celular, expressão gênica (qPCR) e viabilidade celular (MTT). Os genes validados pela qPCR foram AKT, mTOR e PTEN, relacionados com a via AKT-mTOR. A expressão do gene PTEN estava diminuída e do mTOR aumentada nas células de tumores primários, quando comparadas as suas metastases. O tratamento com rapamicina e ensaio MTT foram viii realizados nas concentrações de 2, 5, 10 e 12 μM, por 24, 48 e 72 h. O ensaio de MTT mostrou que para uma diminuição de 50% da viabilidade celular, a concentração de rapamicina deve ser 2 μM para o carcinoma adenoescamoso e 10 μM para metástase. Para o carcinoma sólido grau III e sua respectiva metástase, a concentração utilizada foi de 12 μM. A rapamicina teve um resultado satisfatório na inibição do crescimento dos dois tipos celulares utilizados nesse estudo. Neoplasms are becoming increasingly common among animals, whether due to longer life expectancy or new diagnostic methods and treatments. Breast neoplasms are the most common type of neoplasm among canine females. The search for new treatments and / or specific treatments for animals is increasingly common in this context. Rapamycin is an antifungal drug with antitumor activity, which acts to inhibit the mTOR comple. It was already tested for the treatment of neoplasms in different organs in humans and may be an alternative in the treatment of neoplasms in dogs. Due to the large number of replicates required by drug assays, in vitro cell culture is an early alternative for the discovery of new drugs that might be effective in treatment of this species, as well as becoming a preclinical assay. The aim of this study was to evaluate the effect of rapamycin on primary and metastatic mammary dog tumor on in vitro cultured cells. Two histological types of neoplastic cells from the primary tumor and their respective metastases were used. After collection, the samples were classified by histopathology as grade III solid carcinoma and adenosquamous carcinoma, as non-basal triple negative tumors by immunohistochemistry, and both the primary tumors and their metastases presented positive expression for PTEN, AKT, mTOR and 4EBP1 proteins in immunofluorescence. A fragment of the tumor tissue was cultured in vitro and the cells were evaluated for cell morphology and phenotype, gene expression (qPCR) and cell viability (MTT). The genes validated by qPCR were AKT, mTOR and PTEN, related to the AKT-mTOR pathway. PTEN gene expression was decreased and mTOR increased in primary tumor cells when compared to metastatic tumors. Treatment with rapamycin and MTT assay were performed at concentrations of 2, 5, 10 and 12 μM for 24, 48 and 72 h. The MTT x assay showed that for a 50% decrease in cell viability, the concentration of rapamycin should be 2 μM for adenosquamous carcinoma and 10 μM for its metastasis. For grade III solid carcinoma and its respective metastasis, the concentration used was 12 μM. The treatment with rapamicyn inhibited the cell growth in the two cell types cultured in vitro. CAPES: 001