Caracterización molecular de begomovirus y fitoplasmas asociados a una infección mixta en calabacita Cucurbita pepo L. en B.C.S., México

"Desde 2010, en la región agrícola de La Paz, BCS, México, en el cultivo de calabacita (Cucurbita pepo) se han observado síntomas que se han asociado a una enfermedad mixta en la que pudieran estar involucrados dos patógenos (begomovirus y fitoplasmas) ya detectados en otros cultivos de la región, tales como: hojas pequeñas, severo retraso de crecimiento y deformación de frutos. Relacionados con begomovirus, se han detectado problemas de enrollamiento de la hoja, mosaicos y engrosamiento de venas; y atribuidos a fitoplasmas, amarillamiento y alta proliferación de brotes axilares. Adicionalmente, se observaron chicharritas y altas poblaciones de mosquitas blancas, insectos reportados como vectores de estos patógenos. El objetivo del presente trabajo fue identificar, caracterizar y realizar el estudio filogenético de los agentes causales de esta enfermedad, estimar el daño de la infección y llevar a cabo la identificación de los vectores. En el caso de los begomovirus, se realizó PCR con cebadores degenerados que amplifican la cubierta proteica y la región intergénica. Se obtuvo la secuencia completa del genoma con la técnica de círculo rodante, que analizada por alineamiento múltiple con otros begomovirus disponibles en GenBank, se comprobó una identidad entre el 98.8-99.1%. El aislado de BCS pertenece al begomovirus Squash leaf curl virus SLCuV-[MX:BCS:La Paz:17] GenBank MF187211A. La caracterización molecular del virus mostró que el SLCuV-BCS es un begomovirus bipartita, con componentes genómicos (A y B) de 2,638 y 2,608 pb; con 5 marcos de lectura abiertos en A y dos en B. El análisis filogenético mostró que SLCuV-[MX:BCS:La Paz:17] se establece entre dos grupos filogenética y geográficamente bien definidos como el clado SLCuV de Medio Oriente y SLCuV de Estados Unidos. La detección preliminar de fitoplasmas se hizo con MEB, donde se confirmó la presencia del patógeno de acuerdo a las características morfológicas observadas en los tejidos vasculares. La identificación y caracterización se realizó por PCR anidada amplificando la región del gen 16S ARNr de 1.2 kb. El análisis de alineamiento múltiple de las secuencias nt arrojó una similitud del 98.6% con 'Candidatus Phytoplasma pruni'. Se observó la firma genética ´CAAGAYBATKATGTKTAGCYGGDCT´, que establece la identidad de especie del fitoplasma. Los análisis filogenéticos ubicaron el aislado de BCS dentro del grupo 16SrIII..." Symptoms have been observed in the cultivation of the squash Cucurbita pepo in the agricultural region of La Paz, Baja California Sur (BCS), Mexico, which could be associated with a mixed disease where two pathogens (begomovirus and Phytoplasmas) were involved before and detected in other crops in the region since 2010. The symptoms associated with the mixed infection were: small leaves, severe stunted growth and fruit deformation. In addition, curled leaf, mosaic and vein thickening symptoms have been observed related to begomovirus and yellowing and high proliferation of axillary buds to Phytoplasmas. Moreover, leafhoppers and high populations of whitefly insects reported as vectors of these pathogens were observed. Thus the objective of this work was to identify, characterize and carry out a phylogenetic study of the causative agents of this disease to estimate infection damage and the identification of the vectors. In the case of begomoviruses, PCR was performed with degenerate primers that amplify the protein coat and the intergenic region. The complete genome sequence was obtained with the rolling circle technique, which by analyzing multiple alignments with other available GenBank begomoviruses obtained an identity from 98.8-99.1%. The isolate of BCS belonged to the begomovirus Squash leaf curl virus SLCuV-[MX:BCS:La Paz:17] GenBank MF187211A. The molecular characterization of the virus showed that SLCuV-BCS is a bipartite begomovirus with genomic components (A and B) of 2,638 and 2,608 bp, with 5 open reading frames in A and two in B. The phylogenetic analysis showed that SLCuV-[MX:BCS:La Paz:17] was established between two phylogenetic and geographically well defined groups such as the SLCuV clade of the Middle East and SLCuV of the United States of America. The preliminary detection of phytoplasmas was performed with scanning electron microscope where the presence of the pathogen was confirmed according to the morphological characteristics observed in the vascular tissues. The identification and characterization was performed by nested PCR amplifying the region of the 16S rRNA gene of 1.2 kb. The multiple alignment analysis of the nt sequences indicated a similarity of 98.6% with 'Candidatus Phytoplasma pruni'. The genetic signature 'CAAGAYBATKATGTKTAGCYGGDCT' was observed, establishing the identity of the phytoplasma species. Phylogenetic analyzes located the BCS isolate within the 16SrIII group..."