Mechanisms involved in the development and the maintenance of the exocytosis highly coupled in chromaffin cells

En esta tesis se estudiaron los mecanismos asociados con la exocitosisvesicular altamente acoplada al estímulo, su recuperación, y su mantenimientofrente a la aplicación de potenciales de acción a bajas frecuencias deestimulación, propias del estado basal de estas células. En primer lugar, seevidenció que frente a la aplicación de un estímulo que simula un potencial deacción se libera un grupo de ≈ 8 vesículas, al que denominamos ETAP (porexocytosis triggered by action potential). Este pool vesicular está incluido en elpool inmediatamente liberable (IRP, ≈ 25 vesículas), y su exocitosis depende enun 50% de fuentes de Ca2+ extracelulares y en un 50% de un mecanismoindependiente del influjo de Ca2+. Mientras que IRP recupera lentamente (τ ≈ 7 s)luego de ser deprimido, ETAP presenta una rápida cinética de recuperación (τ ≈ 0.7 s). Esta recuperación depende de dos procesos: (i) transferencia devesículas desde pooles vesiculares río arriba, y (ii) una endocitosis rápidadependiente de dinamina y altamente acoplada a la exocitosis precedente. En lasegunda parte de esta tesis se investigó el mecanismo de exocitosisindependiente del influjo Ca2+ mencionado previamente. Utilizandodespolarizaciones cuadradas de 100 ms (máxima respuesta), se determinaron lasiguientes características para dicho fenómeno: (i) independencia de fuentesextracelulares e intracelulares de Ca2+; (ii) dependencia de la proteína SNAREsinaptobrevina; (iii) dependencia sigmoidea con el voltaje aplicado; (iv) losresultados sugieren que el sensor de voltaje sería el canal de Ca2+ tipo P/Q, yque interaccionaría con la maquinaria exocitótica a través de la secuenciasynprint. En resumen, los resultados muestran que un potencial de acción induceuna exocitosis altamente acoplada y sincrónica al estímulo que es dependienteen parte de un mecanismo activado por Ca2+ y en parte de otro activadodirectamente por voltaje. Finalmente, demostramos que esta exocitosis, graciasa su rápida velocidad de recuperación vesicular, es capaz de mantener lasecreción de manera continua a frecuencias basales fisiológicas. In resting conditions, chromaffin cells fire action potentials at frequenciesof 0.2-0.5 Hz, while under stress the frequency increases to 10-15 Hz. In thisthesis we studied the mechanisms involved in the development and maintenanceof exocytosis in response to the application of action potentials, individually andat low frequencies. In first place, we showed that the application of a stimulus thatresembles a single action potential induced the release of a group of ≈ 8 vesiclesthat we defined as “exocytosis triggered by action potential” (ETAP). Our resultsshow that this pool is part of the immediately releasable pool (IRP ≈ 25 vesicles),and its exocytosis depends 50% on extracellular Ca2+ sources and 50% on amechanism that is independent of Ca2+ influx. While IRP refilling is slow (τ ≈ 7 s)after depletion, ETAP showed a fast kinetic of recovery (τ ≈ 0.7 s). This recoverydepends on two processes: (i) vesicular transference from upstream pools, and (ii) a fast dynamin-dependent endocytotic process, which is tightly coupled to theprecedent exocytosis. In the second part of this thesis we investigated the Ca2+-independent exocytotic mechanism previously mentioned. Using squaredepolarizations pulses of 100 ms (maximal response), the followingcharacteristics were determined for this phenomenon: (i) independence onexternal and internal Ca2+ sources; (ii) dependence on the SNARE proteinsynaptobrevin; (iii) sigmoidal dependence with the voltage applied; (iv) the resultssuggest that the voltage sensor could be the P/Q type Ca2+ channel, which caninteract with the exocytotic machinery through its synprint sequence. In summary,our results show that an action potential induces an exocytotic response highlycoupled, and synchronous with the stimuli, which depends in part on amechanism activated by Ca2+ and in part on other mechanism activated directlyby voltage. Finally, we demonstrated that this exocytosis, due to its fast vesicularrecovery, is able to maintain the secretion under the application of actionpotentials at basal physiological frequencies. Fil: Moya Díaz, José. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.