Toxigenic Aspergillus in coffee and cocoa : incidence, mycotoxins production and real-time PCR discrimination of Aspergillus niger

Orientadores: Anderson de Souza Sant'Ana, Marta Hiromi Taniwaki Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O uso das técnicas moleculares para identificação de micro-organismos é indispensável em pesquisas cientificas. A dificuldade em caracterizar e identificar fungos do gênero Aspergillus ocorre devido ao fato de algumas espécies estarem intimamente relacionadas entre si, e as diferenças morfológicas entre os indivíduos serem praticamente imperceptíveis. O gênero Aspergillus engloba importantes fungos toxigênicos presentes em alimentos. Desta maneira este trabalho teve como objetivo a caracterização da micobiota toxigênica de cacau e café provenientes dos estados de Espírito Santo, Minas Gerais, São Paulo, Bahia e Pará e o desenvolvimento de uma metodologia para identificação de Aspergillus niger baseada em técnicas moleculares. Foram analisadas 114 amostras, divididas em 64 amostras de café e 50 amostras de cacau. Para o isolamento dos fungos, foi realizado o plaqueamento direto em ágar Dicloran 18% Glicerol (DG18), após desinfecção com hipoclorito de sódio 0,4 %. Um total de 1020 fungos proveniente do café e cacau, foram isolados em meio de cultura Czapek Extrato de levedura (CYA), sendo que, 769 (75,4%) foram identificados como gênero Aspergillus, 120 (11,8%) Eurotium, 52 (5%) hifomicetos, 41 (4%) Penicillium e 24 (2,4%) Fusarium. Dos 429 isolados de cacau, 267 pertenciam à seção Flavi. Em café foram 591 isolados, dos quais 451 foram identificados como A. section Nigri. Na avaliação de produção de micotoxinas, pela técnica de ágar plug associada à cromatografia de camada delgada (TLC), verificou-se que 25 % das cepas de A. section Flavi foram produtoras de aflatoxinas, enquanto que 8% dos 471 isolados de A. section Nigri foram produtores de Ocratoxina A (OTA). Para as análises moleculares foram selecionadas 127 cepas pertencentes à seção Nigri isolados das amostras de cacau e café. Para extração do DNA dois kits foram testados: PowerLyzerTM Power Soil® DNA Isolation Kit da MOBIO e o kit PrepManTM Ultra da Applied Biosystems. O Kit PowerLyzerTM Power Soil® DNA Isolation foi escolhido para efetuar as análises, por apresentar maior reprodutibilidade nos testes. Das 127 cepas analisadas 112 foram identificadas por PCR em tempo real como A.niger/A. welwitschiae. A.niger e A. welwitschiae são espécies irmãs em curso de especiação, o que torna sua identificação bastante difícil, mesmo utilizando técnicas moleculares. Contudo apesar destas dificuldades, a correta identificação através das técnicas moleculares é necessária, tornando-se uma valiosa ferramenta para auxiliar no controle de qualidade e pesquisas em micologia de alimentos, uma vez que estas duas espécies são produtoras de OTA Abstract: Molecular techniques to identify micro-organisms are becoming an indispensable tool in scientific research. The difficulty in characterizing and identifying fungi of the genus Aspergillus is due to the fact that some species are closely related to each other, and morphological differences between them are practically imperceptible. The genus Aspergillus is an important group of toxigenic fungi present in food. The aim of this study was the characterization of cocoa and coffee toxigenic mycobiota from the states of Espírito Santo, Minas Gerais, São Paulo, Bahia and Pará. And the development of a molecular methodology for identification of Aspergillus niger. One hundred and fourteen samples were analyzed, divided into 64 cocoa 50 coffee samples. For isolation of fungi, the samples, waere plated in agar Dichloran Glycerol 18% (DG18) after disinfection with sodium hypochlorite 0,4%. A total of 1020 fungi have been isolated in CYA, of which, 769 (75.4%) were identified as genus Aspergillus, 120 (11.8%) Eurotium, 52 (5%) hyphomycetes, 41 (4%) Penicillium, 24 and (2 ,4%) Fusarium. Of the 429 cocoa isolates, 267 belonged to section A. Flavi. In Coffee 591 fungus were isolated, of which 451 were identified as A. section Nigri. The production of mycotoxins evaluation, showed that 25% of the strains isolated as A. section Flavi were producing aflatoxins, while 8% of 471 A. section Nigri were producing ochratoxin A. For the molecular analysis were selected 160 strains belonging to A. Nigri section. For DNA extraction two kits were tested. The PowerLyzerTM Power Soil® DNA Isolation Kit Mobio and PrepMan Ultra kit from Applied Biosystems. The Mobio Kit was chosen for the analysis due to its reproducibility. Of the 127 strains analyzed, 112 were identified as A.niger/A. welwitschiae. A.niger and A. welwitschiae are close species in the process of speciation, which makes their identification, even with molecular techniques, very dificult. Nevertheless these two species are OTA producers and their identification is a valuable tool for food mycology research Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos CNPQ 149842/2013-9 FAPESP 2011/50136-0