Modulation of the highly-coupled vesicular pools replenishment in mouse chromaffin cells

El pool de vesículas inmediatamente liberables (IRP) es un pool vesicular que se libera frente a pulsos despolarizantes de corta duración debido a su proximidad a los canales de Ca2+. [fórmula aproximada, revisar la misma en el original]. En esta tesis estudiamos los mecanismos asociados a la recuperación del IRP luego de que este es deprimido por exocitosis en células cromafines adrenales. Nuestros resultados muestran que la recuperación del IRP presenta dos componentes cinéticos, con constantes temporales de ~1 s y ~10 s respectivamente. Mientras que el aumento del Ca2+ citosólico basal hace desaparecer el componente rápido y acelera al lento, la disminución del Ca+2 basal (por agregado de concentraciones crecientes de BAPTA) genera el efecto inverso, acelerando el componente rápido y anulando al lento. La presencia y velocidad del componente rápido a su vez se correlacionó con un proceso de endocitosis rápida, tanto cuando se modificó el Ca2+ citosólico basal, como cuando se afectó directa-mente la endocitosis con un anticuerpo anti-dinamina. Dado que observamos que la disminución en la concentración del Ca2+ citosólico basal se asociaba a un aumento de la densidad de la actina-F cortical, postulamos que dicha proteína podría estar involucrada en los cambios observados en la endocitosis y la recuperación de IRP con el Ca2+. El pretratamiento de nuestras células con el despolimerizante de actina citochalasyn-D logró revertir los aumentos observados en las velocidades de endocitosis y recuperación alcanzadas a alta concentración (4 mM) de BAPTA. A partir de los resultados descriptos arriba postulamos que a bajas concentraciones basales de Ca2+ la actina-F cortical se encuentra altamente agregada, favoreciendo la endocitosis rápida, que sería la primera etapa de un proceso rápido de recuperación de IRP. Esto es coherente con las observaciones de otros autores (ver Introducción) respecto a que los niveles bajos de Ca2+ citosólico y la actina-F cortical promueven un proceso de kiss-and-run. Dichos resultados apoyan la idea de que la remodelación de la actina-F cortical en forma Ca2+ dependiente es un elemento importante en la regulación de las características del ciclado de vesículas densas secretorias. The immediately releasable pool (IRP) is composed of ready releasable vesicles sensitive to short depolarizations because of their proximity to voltage-dependent calcium channels. In this thesis we studied the mechanisms involved in IRP recovery after depletion in adrenal chromaffin cells. Our results showed that IRP recovery presents two kinetic components, with time constans of ~1 s y ~10 s respectively. While high cytosolic Ca2+ concentrations abolished the rapid component and accelerated the slower one, low Ca2+ (attained by addition of increasing concentrations of intracellular BAPTA) provoked the opposite effect, inhibiting the slow component and accelerating the rapid one. There was also a positive correlation between the rapid component of recovery with a fast endocytosis process. This correlation was observed when the cytosolic Ca2+ was modified or when endocytosis was inhibited with an anti-dynamin antibody. Finnally, we found that the decrease in cytosolic Ca2+ concentration is associated with cortical F-actin aggregation, and postulated that this effect can explain in part the changes observed in endocytosis and IRP recovery. In fact, the effects produced by high cytosolic (4 mM) BAPTA concentration on endocytosis and IRP recovery kinetics were reverted by application of cytochalasin-D, an actin-F depolymerizing drug. We propose that the elevated aggregation of cortical F-actin at low basal cytosolic Ca2+ concentrations facilitates fast endocytosis, which would be the first stage of a rapid mechanism of IRP recovery. These results support the idea that the remodeling of cortical F-actin in a Ca2+ dependent manner would be an important element in the regulation of the dynamics of dense secretory vesicles cycling. Fil: Montenegro, Mauricio Norman. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.