Functional and structural analysis of the phasin PhaP from Azotobacter sp. FA8 and its role in recombinant Escherichia coli

Las phasinas son un grupo de proteínas que se encuentran asociadas a gránulosde polihidroxialcanoatos (PHA). Además de su rol estructural como parte de lacubierta del gránulo, se han encontrado diferentes funciones estructurales yregulatorias asociadas a varias de estas proteínas, y se han desarrollado aplicacionesbiotecnológicas utilizando proteínas fusionadas a phasinas. A pesar de su diversidadfuncional, la estructura de estas proteínas ha sido analizada en detalle en muy pocosestudios. PhaP de Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) pertenece al grupo más representado dela multifuncional familia de las phasinas. Esta proteína ha sido clonada y expresadaen Escherichia coli. Las cepas recombinantes de E. coli que sobreexpresan phaPAzcrecen más y acumulan más polímero, lo que sugiere que PhaPAz ejerce un efectopromotor del crecimiento. Se observó también que la expresión de PhaPAz tiene uninesperado efecto protector en E. coli no productora de PHA, tanto en condicionesnormales como en condiciones de estrés, resultando en un mayor crecimiento ymayor resistencia a estrés oxidativo y estrés térmico. El objetivo de este trabajodoctoral es realizar una caracterización funcional y estructural de esta phasina paraestudiar sus diversas propiedades y dilucidar el mecanismo por el cual ejerce suefecto protector. Su estructura primaria reveló que no posee claros dominioshidrofóbicos, característica que parece ser común a la mayoría de las phasinas, apesar de su capacidad de unión a gránulos lipídicos. La estructura secundaria de estaproteína consiste en α-hélices, combinadas con regiones desestructuradas que leconfieren una notable flexibilidad dependiente del entorno. Los datosexperimentales obtenidos revelaron que PhaPAz es un tetrámero formado porinteracciones de tipo coiled coil entre los monómeros. Estas característicasestructurales tambén fueron encontradas en otras phasinas y podrían estarrelacionadas con su diversidad funcional. Se realizaron experimentos de actividadchaperona in vitro para dilucidar el mecanismo por el cual PhaPAz ejerce su efectoprotector. PhaPAz demostró evitar la agregación térmica de la proteína Citrato Sintasa (CS) y facilitar el proceso de replegado de la enzima luego de ladesnaturalización por métodos químicos in vitro. Estos experimentos mostraronque PhaPAz tiene actividad chaperona in vitro. Se utilizaron técnicas de microscopíade fluorescencia y de transmisión electrónica para analizar la localizaciónintracelular de PhaPAz en cepas de E. coli productoras y no productoras de PHB conel objetivo de estudiar el rol de PhaPAz en el plegado de proteínas in vivo, el agregadode proteínas y la dinámica de formación de cuerpos de inclusión. PhaPAz colocalizócon los cuerpos de inclusión de PD, proteína que forma grandes y visibles agregadoscuando es sobreexpresada en E. coli. Se observó una reducción en el número decuerpos de inclusión cuando PD fue coproducida con PhaPAz o con la chaperona GroELS. Estos resultados demuestran que PhaPAz presenta actividad chaperonatanto in vitro como in vivo en E. coli recombinante, y sugieren que las phasinaspodrían tener un rol protector general en los productores naturales de PHA. Estasobservaciones hacen posible el uso de esta proteína en el desarrollo de nuevasaplicaciones biotecnológicas, como por ejemplo la producción de proteínasrecombinantes y otros productos heterólogos en E. coli. Phasins are a group of proteins associated to granules ofpolyhydroxyalkanoates (PHAs). Apart from their structural role as part of the PHAgranule cover, different structural and regulatory functions have been foundassociated to many of them, and several biotechnological applications have beendeveloped using phasin protein fusions. Despite their remarkable functionaldiversity, the structure of these proteins has not been analyzed except in very fewstudies. PhaP from Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) is a representative of the prevailingtype in the multifunctional phasin protein family. This protein has been cloned andexpressed in Escherichia coli. Recombinant E. coli strains overexpressing phaPAzgrow more, and accumulate more polymer, suggesting that PhaPAz exerts a growthpromoting effect. Expression of PhaPAz was also observed to have an unexpectedprotective effect in E. coli strains that do not synthesize PHAs, under both normaland stress conditions, resulting in increased growth and higher resistance to bothsuperoxide stress and heat shock. The aim of this work was to perform aphysiological and structural characterization of this protein, to shed light on itsproperties. Its secondary structure revealed that it lacks clear hydrophobic domains,a characteristic that appears to be common to most phasins, despite their lipidgranule binding capacity. The secondary structure of this protein, consisting of α-helices and disordered regions, has a remarkable capacity to change according to itsenvironment. Several experimental data support that is a tetramer, probably due tointeractions between coiled-coil regions. These structural features have also beendetected in other phasins, and may be related to their functional diversity. In vitrochaperone activity experiments were performed in order to shed light on themechanisms by which PhaPAz exerts its protective effect. PhaPAz was shown toprevent in vitro thermal aggregation of the model protein citrate sinthase (CS) andto facilitate the refolding process of the enzyme after chemical denaturation. Theseexperiments showed that PhaPAz presents in vitro chaperone activity. Fluorescencemicroscopy and electron transmission microscopy were used to analyze thesubcellular localization of PhaPAz in PHB producing and non PHB producing E. colistrains and to study the role of PhaPAz in in vivo protein folding, protein aggregationand inclusion body dynamics. PhaPAz was shown to colocalize with inclusion bodiesof PD, a protein that forms large inclusion bodies when overexpressed. A reductionin the number of inclusion bodies of PD was observed when the insoluble protein PD was coexpressed with PhaPAz or with the known chaperone GroELS. Theseresults demonstrate that PhaPAz has chaperone like functions both in vitro and invivo in E. coli recombinants, and suggests that phasins could have a generalprotective role in natural PHA producers, that in these microorganisms is maskedby the fitness enhancing properties of the polymer. These observations open thedoor for novel biotechnological applications of this protein, for example, in theproduction of recombinant proteins and other heterologous products in E. coli. Fil: Mezzina, Mariela Paula. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.