Detecção e caracterização de Rickettsia spp. circulante em foco inativo peri-urbano do município de Caratinga, MG

As riquétsias patogênicas constituem um grupo de bactérias gram-negativas, intracelulares obrigatórias responsáveis por várias doenças humanas conhecidas como riquetsioses, as quais são transmitidas ao homem através da picada de artrópodes hematófagos como carrapato, pulga e piolho. O Brasil apresenta histórico de doença riquetsial desde o final da década de 20, sendo a febre maculosa brasileira a mais severa das riquetsioses descritas, com inúmeros casos confirmados através de sorologia no sudeste do país. A introdução de técnicas da biologia molecular no estudo das riquétsias tem possibilitado a caracterização de espécies já existentes como a Rickettsia rickettsii, bem como a descrição de novas espécies tais como a Rickettsia felis. O presente trabalho teve por objetivo detectar a presença de Rickettsia spp. circulante em artrópodes vetores em um foco inativo peri–urbano do município de Caratinga, MG, através da reação em cadeia da polimerase e avaliar o nível de transmissão de riquetsioses na população animal do domicílio e peri–domicílio. 2610 ectoparasitos, em fase parasitária, foram coletados entre maio/2002 e abril/2003, taxonomicamente identificados, agrupados de acordo com estádio evolutivo e animal de origem e submetidos à extração de DNA pelo método do fenol/clorofórmio. O DNA extraído foi amplificado por meio de uma PCR duplex contendo dois pares de oligonucleotídeos iniciadores gênero específicos: citrato sintase - gltA (RpCS877p; RpCS1258n) e 17 KDa(17kDa F; 17kDa R), sendo o produto obtido reamplificado com um par de iniciadores internos do gene que codifica a proteína interna de membrana de 17kDa (full nested PCR). Os produtos amplificados foram visualizados em gel de poliacrilamida 8% corado pela prata e as amostras positivas foram clonadas, purificadas, seqüenciadas, editadas e comparadas com outras seqüências depositadas no GenBank utilizando os programas Chromas e BLASTn. Alternativamente, produtos de PCR’s positivas foram purificados e diretamente seqüenciados. Foram também coletadas 73 amostras de soro canino e 18 amostras de soro eqüino por venocentese da cefálica e da jugular, respectivamente, sendo estas submetidas à reação de imunofluorescência indireta usando antígeno específico de R. rickettsii. A análise das seqüências obtidas de pools de pulgas do gênero Ctenocephalides e de pools de carrapatos das espécies Amblyomma cajennense e Rhipicephalus sanguineus permitiu a identificação de riquétsias com 100% de homologia com R. felis e 97% de homologia com Rickettsia honei e R. rickettsii, simultaneamente. Nenhum dos soros caninos analisados apresentou resultado positivo à RIFI enquanto 3 dos soros eqüinos (17%) apresentaram-se positivos nos título 1:64 e 1:128. Os dados obtidos mostram que o foco estudado representa uma região vulnerável com relação à transmissão de riquetsioses, fazendo-se necessário o estabelecimento de um sistema de vigilância epidemiológica no referido local. The pathogenic Rickettsiae are obligate intracellular gram-negative bacteria associated with hematophagous arthropods such as ticks, fleas and lice that while feeding, can transmit Rickettsiae to animals and humans. In Brazil, riquetsial diseases has been described in the southeast of the country since 1929. Brazilian spotted fever is the most significant and severe rickettsial disease described with many cases confirmed by serology in the southeast of the country. The introduction of molecular biology tools in rickettsial diseases investigation allowed the detection of many species already known such as Rickettsia rickettsii and new species such as Rickettsia felis. The objective of the present study was to detect Rickettsia spp. in vectors by PCR and to investigate the presence of antibodies for the spotted fever Rickettsiae group in sera from pet animals in Caratinga-MG, Brazil. From may/2002 to april/2003, 2610 arthropods were collected . The ticks and fleas were polled in pools ranging from 1 to 8 specimens per pool, separeted by life stage and sex. The DNA was extracted by phenol-chloroform method and a duplex PCR was performed using, in the first reaction, two oligonucleotide primer pairs: citrate synthase (gltA)- RpCS877p; RpCS1258n and 17kDa genus common protein (17kDa F; 17kDa R). The PCR products were reamplified using a nested primer pair from the 17 kDa genus common protein (full nested PCR). The PCR products were electrophoresed in 8% polyacrylamide gel silver stained. Each positive PCR product were cloned and cycle sequenced or purified and directly sequenced. The sequences obtained were edited and assembled by using Chromas software and compared with other Rickettsia species sequences in the GeneBank database by using BLASTn utility. Sera samples from pet dogs (n=73) and from horses (n=18) were tested by indirect fluorescent antibody (IFA) using Rickettsia rickettsii antigen. Nucleotide sequences of the gene n - 17kDa (232 pb) from Ctenocephalides fleas , Amblyomma cajennense and Riphicephalus sanguineus ticks were 100% identical to R. felis. Another nucleotide sequences of the gene n - 17kDa (232 pb) from Amblyomma cajennense were similar to R. rickettsii and R. honei (97% for both).Three of the horses sera tested (17%) had positive antibody titers ranging from 1:64 to 1:128. All the dogs sera were negative by IFA. The detection of Rickettsiae species potencially pathogenic for humans and the presence of equine seroreactivity to spotted fever Rickettsiae group show the risk of transmission of rickettsial disease and the need of improving a continuous epidemiologic surveillance system for them in this region.