Structural and functional studies of the enzyme N5, N10 -methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolase of Xanthomonas albilineans applied to the discovery of inhibitor candidates for the treatment of leaf scald

A escaldadura das folhas, causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas albilineans, é uma das doenças mais importantes que afetam o cultivo da cana-de-açúcar, causando significativa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda da qualidade do caldo extraído. O impacto dessa doença somado à ausência de agentes químicos ou biológicos para o controle estimula a pesquisa para a descoberta e desenvolvimento de moléculas bioativas como candidatos a novos defensivos agrícolas. Nesse contexto, a enzima N5, N10-metilenotetrahidrofolato desidrogenase ciclohidrolase (FolD) destaca-se como potencial alvo molecular. O projeto de doutoramento visou a caracterização estrutural e funcional da FolD de X. albilineans (XaFolD), além da triagem de moléculas candidatas a inibidores. Para tanto, foram conduzidos estudos integrados em biologia molecular estrutural e química biológica. A expressão heteróloga e purificação da XaFolD resultaram na produção de proteína funcional e adequada aos ensaios de cristalização. A caracterização das atividades desidrogenase e ciclohidrolase da XaFolD indicou os valores de KM para os substratos de ambas as reações, N5, N10-metileno-tetrahidrofolato (50 ± 10 µM) e N5, N10-metenil-tetrahidrofolato (32 ± 3 µM) e do cofator NADP+ (688 ± 81 µM). A estrutura da XaFolD na forma apo, elucidada a 2,1 Å de resolução, revelou uma proteína constituída por 11 hélices alfa e 9 fitas beta distribuídas em um domínio N-terminal catalítico e um domínio C-terminal de ligação ao dinucleotídeo. A enzima pura foi utilizada para a triagem de 1.124 fragmentos por interferometria de biocamada (BLI) e foram identificados três ligantes, DDD00808259 (KD = 260 μM), DDD01305586 (KD = 3 mM) e DDD00100784 (KD = 210 μM), com valores de afinidade na faixa do submilimolar até baixo milimolar. Paralelamente, uma abordagem computacional foi empregada para a triagem virtual de base de dados de compostos como candidatos a ligantes da XaFolD. Os critérios utilizados resultaram na seleção e aquisição de 31 compostos de diferentes classes químicas para avaliação da atividade inibitória frente a enzima alvo. Por fim, ensaios fenotípicos de triagem de inibidores resultaram na descoberta de compostos capazes de inibir o crescimento in vitro de X. albilineans. Dentre os inibidores identificados o composto THP2 apresentou a maior potência, com valor determinado de EC50 igual a 23 ± 2 μM. Os dados estruturais, cinéticos e biofísicos obtidos nesta tese de doutoramento formam a base experimental e computacional para a descoberta e planejamento de inibidores candidatos a novos agroquímicos para o tratamento da escaldadura das folhas. The leaf scald disease is a severe condition which affects sugarcane crops. Leaf scald is caused by the Gram-negative bacteria Xanthomonas albilineans and it has a dramatic impact on crop productivity, including the yield reduction and dropping the quality of the juice. The impact of this disease besides the absence of chemical or biological agents to treat it stimulates the research towards the discovery and development of bioactive molecules as lead candidates to new agrochemicals. In this context, the enzyme N5, N10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolase (XaFolD) stands out as a potential molecular target. Facing this scenario, the PhD project comprised the structural and functional characterization of X. albilineans FolD (XaFolD) and the screening of molecules to identify inhibitors. For this purpose, integrated studies in structural molecular biology and biological chemistry have been carried out. Suitable protein for crystallization and kinetic assays was produced by heterologous expression. The XaFolD dehydrogenase and cyclohydrolase activities were characterized, revealing KM values of 50 ± 10 µM for N5, N10- methylenetetrahydrofolate, 32 ± 3 µM for N5, N10-methenyltetrahydrofolate, and 688 ± 81 µM for NADP+. The structure of XaFolD in the apo form was elucidated at 2.1 Å resolution and it revealed a protein consisting of 11 alpha helices and 9 beta sheets distributed in the catalytic N-terminal domain and the C-terminal dinucleotide binding domain. Screening of 1,124 fragments by biolayer interferometry (BLI) revealed three ligands, DDD00808259, DDD01305586 and DDD00100784, with determined KD values of 260 µM, 3 mM and 210 M, respectively. Furthermore, a virtual screening was performed to identify XaFolD ligands. As a result, 31 chemically diverse compounds were selected to be evaluated by potency assays. Additionally, phenotypical assays against X. albilineans have been performed and inhibitors were identified. Among them, the compound THP2 presented the highest potency, with a determined value of EC50 equal to 23 ± 2 µM. The structural, kinetic, and biophysical data obtained in this PhD thesis provide the molecular basis for discovering and planning bioactive molecules as agrochemicals to control leaf scald disease.