Virtual screening and experimental validation of casein kinases (CKs) inhibitors from Plasmodium spp. with antimalarial potential

Orientadores: Fabio Trindade Maranhão Costa, Gustavo Capatti Cassiano Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A malária é uma doença infecciosa que causa milhares de mortes todos os anos ao redor do mundo. O uso de antimaláricos é fundamental para a contenção da doença e tratamento dos infectados. A recorrente resistência parasitária aos antimaláricos vigentes torna necessário o constante estudo para o desenvolvimento de novos compostos químicos, capazes de atuar na morte do parasita por modos de ação inéditos. Com o sucesso de inibidores de quinases para o tratamento do câncer, o quinoma (conjunto de quinases presente no proteoma do parasita) do Plasmodium spp. passou a ser investigado, com o intuito de encontrar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da malária. Através de filtros de bioinformática, escolhemos as proteínas Caseína quinase 1 (CK1) e 2 (CK2) de Plasmodium spp. como alvo para a seleção de compostos químicos para testes. A CK1 é conservada entre as espécies de Plasmodium, altamente expressa em todo o ciclo sanguíneo do parasita e tem interação física com a proteína Rab-5B evidenciando assim fazer parte do controle metabólico. Além disso, estudos de genética reversa demonstraram que esta proteína é essencial para o desenvolvimento do estágio sanguíneo do parasito. Apesar de pertencerem a mesma família, a CK1 e a Caseína quinase 2 (CK2) são divergentes em estrutura, função e resposta a moléculas efetoras. Experimentos de genética reversa mostraram que a CK2? de P. falciparum é essencial para a sobrevivência do patógeno durante seu ciclo de replicação dentro dos eritrócitos do hospedeiro, tornando, assim como a CK1, a CK2? um alvo promissor para o tratamento e contenção da malária. Com o crescente aumento da capacidade computacional e aprimoramento das triagens in silico, realizamos técnicas de triagens virtuais com o intuito de reduzirmos os testes experimentais e aumentar a capacidade assertiva. Primeiramente, construímos por homologia a estrutura 3D da proteína alvo PvCK1, e para a PfCK2 utilizamos o cristal, e utilizamos dois métodos de triagens complementares, o primeiro baseado na proteína do parasita, Structure-Based Virtual Screening (SBVS) visando identificar inibidores das CKs, e o segundo baseado em QSAR (do inglês Quantitative Structure-Activity Relationship) utilizando a vasta informação na literatura e bancos de dados de moléculas ativas já avaliadas em Plasmodium spp., com o intuito de assegurar que os compostos selecionados tenham atividade in vitro contra as formas assexuadas sanguíneas do parasito. Após a triagem virtual, 183 compostos foram selecionados e testados in vitro contra P. falciparum, sendo que 11 compostos foram capazes de inibir mais que 50% do crescimento parasitário a 1 ?M. Estes compostos foram então avaliados em relação a citotoxicidade em células HepG-2, e MCF-7. Finalmente, foram escolhidos de acordo com estrutura, citotoxicidade e atividade antiplasmodial, 3 compostos para realizar curvas dose resposta contra cepas sensíveis e resistentes de P. falciparum e obtivemos 1 composto apresentando alto índice de seletividade (>100) Abstract: Malaria is an infectious disease that causes thousands of deaths each year worldwide. The use of antimalarials is essential to contain the disease and treat those infected. The recurrent parasitic resistance to current antimalarials, makes it necessary to constantly study for the development of new chemical compounds capable of acting in the death of the parasite through unprecedented modes of action. With the success of kinase inhibitors for the treatment of cancer, the kinome (set of kinases present in the parasite proteome) of Plasmodium spp. started to be investigated in order to find potential therapeutic targets for the treatment of malaria. Through bioinformatics filters, we chose the protein Casein kinase 1 (CK1) and 2 (CK2) from Plasmodium spp. as targets for the selection of chemical compounds for testing.CK1 is conserved among Plasmodium species, highly expressed throughout asexual blood stage development, and has physical interaction with the Rab-5B protein, evidencing being part of the metabolic control. In addition, reverse genetic studies have shown that this protein is essential for the development of the parasite's blood stage. Despite belonging to the same family, CK1 and CK2 are divergent in structure, function, and response to effector molecules. Reverse genetic experiments have shown that P. falciparum CK2? is essential for the survival of the pathogen during its replication cycle within the host's erythrocytes, making, like CK1, CK2? a promising target for the treatment of malaria. With the increasing computational capacity and the improvement of in silico screening, we have performed virtual screening techniques in order to reduce experimental tests and increase assertive capacity. First, we build the 3D structures of the target proteins PvCK1 by homology, and for PfCK2 we use the crystal, and we use two complementary screening methods, the first based on the parasite protein, Structure-Based Virtual Screening (SBVS) to identify CK inhibitors, and the second based on QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) using the vast information in the literature and databases of active molecules already evaluated in Plasmodium spp., in order to ensure that the selected compounds have activity in vitro against the asexual blood forms of the parasite. After virtual screening, 183 compounds were selected and tested in vitro against P. falciparum, with 11 compounds capable of inhibiting more than 50% of parasitic growth at 1 ?M. These compounds were then evaluated for cytotoxicity in HepG-2 cells, and MCF-7. Finally, 3 compounds were chosen according to structure, cytotoxicity and antiplasmodial activity to produce dose response curves against sensitive and resistant strains of P. falciparum and we obtained 1 compound with a high selectivity index (> 100) Mestrado Imunologia Mestra em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2018/05926-2; 2019/17062-5