Transcriptional co-regulation analysis and identification of genes of biotechnological interest in Trichoderma reesei

Orientador: Juliana Velasco de Castro Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os biocombustíveis, em particular o etanol de segunda geração (2G), são hoje uma das principais alternativas sustentáveis à substituição dos combustíveis fósseis em direção à consolidação de uma bioeconomia circular. No Brasil, o etanol 2G é produzido a partir do bagaço e palha da cana-de-açúcar, que são resíduos lignocelulósicos gerados em abundância na cadeia produtiva do setor sucroenergético. Esta tecnologia, entretanto, apresenta ainda algumas limitações econômicas, como o custo elevado dos coquetéis enzimáticos necessários à hidrólise da biomassa lignocelulósica. O fungo filamentoso Trichoderma reesei é considerado a principal plataforma biológica da produção e secreção de celulases e hemicelulases que compõem os coquetéis enzimáticos. Embora o sistema celulolítico e regulação transcricional de T. reesei sejam muito estudados, ainda é necessário investigar o conjunto total de genes relacionados com a degradação de biomassa lignocelulósica por este fungo. Assim, os objetivos principais deste estudo foram a inferência de uma rede de co-expressão gênica baseada no transcriptoma de T. reesei RUT-C30 e a caracterização de alguns genes identificados com potencial biotecnológico em cepas mutantes knockout. A inferência da rede separou os genes hiper-expressos em bagaço (BEX) em diversos módulos, de acordo com o perfil de expressão gênica. Vários genes de (hemi)celulases, transportadores de açúcar, fatores de transcrição e proteínas hipotéticas foram co-expressos nos mesmos módulos. Genes centrais destes módulos (hubs) foram identificados, e incluíram fatores de transcrição e proteínas hipotéticas ainda não caracterizados. A predição in silico de sítios de ligação ao DNA na região promotora para XYR1, o principal ativador de celulases, revelou ainda genes interessantes que podem ser regulados por este fator de transcrição. A partir da análise de rede, seis genes foram escolhidos para serem deletados e caracterizados em T. reesei. Quatro deles foram deletados com sucesso e um gene codificando para um fator de transcrição hipotético do tipo zinc finger mostrou ter papel positivo sobre a degradação de bagaço, uma vez que sua deleção diminuiu significativamente as atividades de celobiohidrolase (pNPC) e beta-glicosidase (pNPG) nesta fonte de carbono. Dados de expressão gênica por qPCR demonstraram também que este gene é alvo da repressão catabólica por carbono mediada pelo regulador CRE1. Adicionalmente, o perfil metabólico de T. reesei e Aspergillus niger crescidos em glicose, celulose solúvel (CMC), lactose e bagaço pré-tratado foi investigado por RMN para avaliar as vias metabólicas utilizadas por estes dois fungos industriais. A fonte de carbono utilizada foi a maior responsável pela variação dos dados, sugerindo que ambos os fungos adotam estratégias semelhantes para crescerem e se adaptarem aos substratos avaliados, mesmo tendo evoluído independemente. Metabólitos de reserva de energia (manitol e trealose), de metabolismo de fosfolipídeos (glicerol-3-fosfocolina) e de aminoácidos (glutamina, alanina e glutamato) foram significativamente mais abundantes em todas as condições amostradas para ambos os fungos. T. reesei assimilou de forma mais eficiente o açúcar lactose, e também parece ativar a via alternativa do TCA (glyoxalate shunt) em CMC como estratégia para produzir energia pela gliconeogênese. A. niger, por outro lado, mostrou níveis mais altos de glicerol e GABA em CMC e lactose. Em BEX, A. niger teve as maiores atividades enzimáticas para celulase e hemicelulase, contribuindo para maior ativação da via glicolítica. Como conclusões deste trabalho, a análise da rede de co-expressão gênica permitiu a identificação de um grande número de genes com potencial biotecnológico na degradação de bagaço de cana. A caracterização dos mutantes knockout levou à descoberta de um suposto ativador transcricional de celulases, mas estudos adicionais devem ser realizados para compreender melhor sua atuação sobre a regulação gênica em T. reesei. O perfil metabólico de T. reesei e A. niger revelou ainda que ambos os fungos utilizam estratégias parecidas com poucas diferenças na utilização de diferentes fontes de carbono, e contribuiu para a maior compreensão da fisiologia dos fungos em condições que induzem a produção de enzimas hidrolíticas. Por fim, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para o maior entendimento do sistema celulolítico em T. reesei e podem ajudar a reduzir os custos associados ao etanol 2G Abstract: Biofuels, especially second generation (2G) ethanol, are today one of the main sustainable alternatives to the replacement of fossil fuels towards the consolidation of a circular bioeconomy. In Brazil, 2G ethanol is produced from bagasse and sugarcane straw, which are lignocellulosic residues generated in abundance in the sugar-energy industry. This technology, however, still presents some economic limitations, such as the high cost of the enzymatic cocktails necessary for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. The filamentous fungus Trichoderma reesei is considered the main biological platform of the production and secretion of cellulases and hemicellulases that compose enzymatic cocktails. Although the cellulolytic system and transcriptional regulation of T. reesei are well studied, efforts are still needed to investigate the entire set of genes related to the degradation of lignocellulosic biomass by this fungus. Thus, the main objectives of this study are the inference of a gene co-expression network based on the T. reesei RUT-C30 transcriptome and the characterization of a few genes with biotechnological potential in mutant knockout strains. The co-expression network analysis separated the upregulated genes in bagasse (BEX) into several modules, according to the gene expression profile. Several genes encoding (hemi)cellulases, sugar transporters, transcription factors and hypothetical proteins were coexpressed in the same modules. Central genes from these modules (hubs) were identified, and included transcription factors and hypothetical proteins still not characterized. The in silico prediction of DNA binding sites in the promoter region for XYR1, the major cellulase activator, has also revealed interesting genes that can be regulated by this transcription factor. From the network analysis, six genes were chosen to be deleted and characterized in T. reesei. Four of them were deleted successfully and one gene encoding a hypothetical zinc finger transcription factor was shown to play a positive role in bagasse degradation, since its deletion significantly decreased the activities of cellobiohydrolase (pNPC) and beta-glucosidase (pNPG) at this carbon source. Gene expression data by qPCR have also demonstrated that this gene is targeted by the CRE1-mediated catabolite repression. In addition, the metabolic profile of T. reesei and Aspergillus niger grown on glucose, soluble cellulose (CMC), lactose and pretreated bagasse was investigated by NMR to evaluate the metabolic pathways employed by these two industrial fungi. The carbon source used was the major responsible for the data variation, suggesting that both fungi adopt similar strategies to grown and adapt to the substrates evaluated, even they had evolved in an independent way. Metabolites of energy reserves (mannitol and trehalose), phospholipids (glycerol-3-phosphocholine) and amino acid metabolites (glutamine, alanine and glutamate) were significantly more abundant in all conditions for both fungi. T. reesei assimilated lactose more efficiently, and it seems to activate the TCA alternative cycle (glyoxalate shunt) in CMC as strategy to produce energy by gluconeogenese. On the other hand, A. niger showed higher levels of glycerol and GABA in CMC and lactose. In BEX, A. niger had greater cellulase and hemicellulase activity, contributing to the activation of glycolysis. As conclusions of this work, the gene co-expression network analysis allowed the identification of a large number of genes with biotechnological potential in the degradation of sugarcane bagasse. The characterization of the knockout mutants led to the discovery of a putative transcriptional activator of cellulases, but additional studies must be conducted to better understand its role in T. reesei gene regulation. The metabolic profile of T. reesei and A. niger had also revealed that both fungi use similar strategies with a few differences in the assimilation of different carbon sources, and contributed to a better understanding of fungal physiology under conditions that induce the production of hydrolytic enzymes. Finally, the results obtained in this work contributed to a better understanding of the T. reesei cellulolytic system and may help to reduce the costs associated with 2G ethanol Doutorado Microbiologia Doutor em Genética e Biologia Molecular CNPQ 141574/2015-1 FAPESP 2015/08222-8; 2017/18987-7