Padronização de um método imuno-histoquímico para confirmação da Leishmaniose tegumentar

A leishmaniose tegumentar americana (LTA), como conhecida nas Américas, trata-se de uma infecção dermatológica resultante da multiplicação intracelular de formas amastigotas de Leishmania em células do sistema fagocítico mononuclear. O diagnóstico precoce e correto da LTA é fundamental para o estabelecimento de um tratamento efetivo, porém, os métodos diagnósticos atualmente disponíveis apresentam baixa sensibilidade, custo elevado ou demandam ampla estrutura técnica e laboratorial. Assim, o objetivo principal desse trabalho foi padronizar um método parasitológico imuno-histoquímico para o diagnóstico de certeza da LTA. A padronização baseou-se em um protocolo previamente descrito por TAFURI et al., (2004), na literatura, utilizando-se o método imuno-histoquímico da estreptoavidina peroxidase, que empregou como anticorpo primário, soro hiperimune de cão naturalmente infectado por Leishmania infantum chagasi. As amostras foram obtidas de 73 pacientes com LTA, não submetidos a qualquer tratamento, procedentes do Ambulatório de Leishmanioses Dr. Paulo de Araújo Magalhães, Caratinga/MG, Todos os pacientes apresentavam lesões típicas da forma localizada da LTA, que variou de uma a quatro lesões, localizadas, sobretudo, em áreas expostas do corpo e com tempo de evolução de 15 a 180 dias. Em sua maioria eram lavradores, residentes na zona rural, pertenciam a ambos os sexos e à faixa etária de 16 a 45 anos. Fragmentos de pele obtidos de biópsias cutâneas foram fixados em solução de formol tamponado e incluídos em parafina. Para a visualização da ligação do anticorpo primário com antígenos de espécies de Leishmania que causam LTA, utilizou-se o complexo da estreptoavidina peroxidase e um polímero livre de biotina. Como exames complementares ao método imuno-histoquímico proposto, foram realizados estudos histológicos por Hematoxilina e Eosina (HE), imuno-histoquímicos empregando-se anticorpo monoclonal anti-lipofosfoglicano (LPG) de Leishmania e a reação em cadeia da polimerase (PCR). As principais alterações histopatológicas apresentadas foram acantose e papilomatose, além de hiperceratose e paraceratose. Na derme observou-se moderado a acentuado infiltrado inflamatório crônico difuso de células mononucleares, principalmente plasmócitos, macrófagos e linfócitos, além de algumas células gigantes do tipo Langhans. Não foi observada reação granulomatosa típica (granuloma completo) e, em algumas amostras foram identificadas áreas de necrose fibrinoíde. A técnica proposta foi padronizada e as formas amastigotas de Leishmania foram facilmente identificadas, com coloração acastanhada, conformação arredondada, em 91,78% dos fragmentos de pele da amostra, sem a ocorrência de coloração de fundo inespecífica (background). A técnica padronizada apresentou elevada sensibilidade para a identificação das amastigotas, que ocorreu de forma mais fácil e rápida, quando comparada com a pesquisa do parasito através da coloração pela Hematoxilina e Eosina, com 17,81% de positividade e pela técnica de imuno-histoquímica, que usou anticorpo monoclonal anti-LPG, que apresentou 71,23% de positividade. O resultado da PCR, embora tenha revelado 100% de positividade, não mostrou diferença estatisticamente significativa quando comparado ao método de imuno-histoquímica (p=0,7671). O uso do polímero livre de biotina como sistema de visualização na técnica de imuno-histoquímica, com soro hiperimune de cão infectado, permitiu reduzir de forma notável o tempo de realização da técnica (de 24 horas para 06 horas), sem elevação do custo final da reação. Conclui-se que o método de imuno-histoquímica padronizado, permitiu o diagnóstico de certeza da LTA com, baixo custo, rapidez e fácil execução quando comparado com outras técnicas de imuno-histoquímica e a PCR. Human Cutaneous Leishmaniasis, in America is known as American Tegumentar Leishmaniasis (LTA), is a cutaneous disease due an infectious agent, a protozoan of genus Leishmania where the amastigotes forms are able to multiply inside cells of mononuclear system of vertebrate host. The earlier and definitive diagnostic for LTA is fundamental to define the the patient treatment. At present, the diagnostic methods have shown low sensibility, laborious and time consuming. Thus, the aim of this study was to patronize an immunohistochemical parasitological method to LTA diagnostic. This study was based on another previously published immunohistochemistry method where it uses serum of a dog naturally infected with Leishmania infantum as primary antibody anti-Leishmania. 73 dermal biopsies samples of patients with LTA, from Caratinga/MG, were fixed in formol buffer solution (10%, pH=7,0) and included in paraffin. Previous parasitological exams were confirmed by positive dermal imprints stained by Giemsa and positive Montenegro Intradermal Reaction (IRM) test, All adult patients of both sex, living in rural zone nearest the forest, showed one to four classical cutaneous lesions of LTA, with 15 to 180 days ears old, mainly localized in external regions of the body as members and face. The immunohistochemistry method using serum hiperimune of dogs naturally infected with Leishmania infantum chagasi as a primary antibody anti-Leishmania was employed in all 73 skin samples. The immune reaction was revealed by the avindin-biotin peroxidase system. In parallel, histological and another immunohistochemistry method using monoclonal antibody anti-lipophosphoglican (LPG) of Leishmania, as a primary antibody, and the polymerase chain reaction (PCR) were carried out. The main histological epithelial alterations were acanthosis, papilomatois, hiperceratosis and parakeratosis. A mononuclear chronic and diffuse exudate composed by plasma cells, macrophages and lymphocytes were observed. In some cases giant cells (Langhans giant cells) could be found, but we did not find a classical granulomatous reaction in any case. The immunohistochemistry method proposal using was patronized because amastigotes forms of Leishmania where easily found in 91.78% of the skin biopsies samples wihout any kind of background. The parasitological diagnosis of LTA carried out the immunohistochemistry method patronized in this work showed higher sensibility than histology in comparison to Hematoxilin-Eosin analysis with 17.81% positive of cases and immunohistochemistry, using monoclonal anti-LPG with 71.23% positive of cases. PCR method revealed 100% of positive of cases, but these results were not statistical significant than the immunohistochemistry method patronized (p=0.7671) here. In addition, we use the polymer system free of biotin in the immunohistochemistry method patronized. It reduced the time consuming of the reaction in at least 06 hours in comparison to the classical protocol. We concluded the immunohistochemistry method patronized to define the parasitological diagnosis for LTA revealed high sensibility, lower time consuming and also less laborious than other diagnostic methods