Purification and biochemical characterization of CGTase produced by Paenibacillus campinasensis H69-3

Submitted by RAISA DÉLI DE OLIVEIRA SANCHES (raisa_oliveira_deli@hotmail.com) on 2019-01-10T18:19:44Z No. of bitstreams: 1 RAISA DELI DE OLIVEIRA SANCHES.docx: 1891575 bytes, checksum: 81221b1c1af43ae35ab5c8f908965ff1 (MD5) Rejected by Paula Torres Monteiro da Torres (paulatms@sjrp.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) É necessário que o arquivo contendo a sua tese esteja no formato Portable Document Format (PDF) e não esteja protegido. Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso. Agradecemos a compreensão. Atenciosamente, Paula Torres on 2019-01-11T15:07:25Z (GMT) Submitted by RAISA DÉLI DE OLIVEIRA SANCHES (raisa_oliveira_deli@hotmail.com) on 2019-01-11T16:56:56Z No. of bitstreams: 1 Raisa Déli de Oliveira Sanches.pdf: 1177874 bytes, checksum: 0573414d14940c313393ec6d6144d643 (MD5) Rejected by Paula Torres Monteiro da Torres (paulatms@sjrp.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Na folha de rosto, falta a natureza da pesquisa. Problema 02) FOLHA DE APROVAÇÃO fora do padrão, na página da Seção de pós-graduação, em Instruções para Qualificação e Defesas de Dissertação e Tese, você pode acessar o modelo das páginas pré-textuais. Problema 03) Na Folha de rosto e folha de aprovação deve constar a financiadora. Ex.: Financiadora: CNPq – Proc. Problema 04) As palavras-chave no abstracts e no resumo devem ser escritas com a inicial maiúscula e separadas por ponto. Problema 05) Não deve constar no sumário, o RESUMO e ABSTRACT, pois são itens pré-textuais. Problema 06) Solicitamos que altere a nomenclatura de REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS para REFERÊNCIAS, segundo a norma ABNT NBR 6023 . Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Sua submissão será rejeitada para que você possa fazer as correções. Agradecemos a compreensão. Atenciosamente, Paula Torres on 2019-01-11T18:04:07Z (GMT) Submitted by RAISA DÉLI DE OLIVEIRA SANCHES (raisa_oliveira_deli@hotmail.com) on 2019-01-11T18:37:20Z No. of bitstreams: 2 Raisa Déli de Oliveira Sanches.pdf: 1177874 bytes, checksum: 0573414d14940c313393ec6d6144d643 (MD5) RAISA DELI DE OLIVEIRA SANCHES.pdf: 1180249 bytes, checksum: 857b5877203d8cb3a107411bb8dc1127 (MD5) Approved for entry into archive by Paula Torres Monteiro da Torres (paulatms@sjrp.unesp.br) on 2019-01-14T11:20:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sanches_rdo_dr_sjrp.pdf: 1180249 bytes, checksum: 857b5877203d8cb3a107411bb8dc1127 (MD5) Made available in DSpace on 2019-01-14T11:20:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sanches_rdo_dr_sjrp.pdf: 1180249 bytes, checksum: 857b5877203d8cb3a107411bb8dc1127 (MD5) Previous issue date: 2018-12-18 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Uma ciclomaltodextrina glucanotransferase (E.C. 2.4.1.19, CGTase) produzida pelo microrganismo Paenibacillus campinasensis linhagem H69-3, foi obtida por fermentação submersa a 45 °C, e a CGTase purificada por cromatografia de afinidade bioespecífica em resina Sepharose 6B ativada com β-CD. A enzima foi purificada até 23 vezes, obtendo um rendimento de 11,0%, e a atividade específica de 32,6 U mg-1 ao final da etapa de purificação. A massa molecular da enzima purificada foi estimada em 72 kDa por eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio. O pH ótimo para a atividade enzimática foi de 6,5 e a enzima foi estável na faixa de pH de 6,5 a 8,0. A temperatura ótima foi de 65 °C em pH 6,5, e foi térmicamente estável até 55 °C na ausência de substrato durante 1 h de incubação e estável até 65 °C na presença de Ca2+ 5 mmol L-1. A atividade enzimática aumentou na presença de Ba2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, K+, Zn2+ e foi inibida na presenca dos íons metálicos Cu2+, Hg2+, Ag+, Li2+, Al3+ e NH42+ e por β‑, γ‑CD, DMSO, Triton, SDS e NaN3. Utilizando maltodextrina como substrato a CGTase apresentou 11,0±0,5 µmol min·mg e 0,30 ± 0,07 mg mL‑1, Vmáx e Km, respectivamente. Avaliaram-se os parâmetros termodinâmicos da CGTase, que demonstrou mais de 11 horas a 65 ºC como tempo de meia vida, e elevada resistência estrutural à desnaturação térmica quando avaliados os resultados de entropia, energia de ativação e entalpia. A cyclomaltodextrin glucanotransferase (E.C. 2.4.1.19, CGTase) produced by 4 microorganism Paenibacillus campinasensis strain H69-3 was obtained by submerged fermentation at 45 °C and CGTase purified by biospecific affinity chromatography on β-CD activated Sepharose 6B resin. The enzyme was purified up to 23 times, yielding 11.0% yield, and the specific activity of 32.6 U mg-1 at the end of the purification step. The molecular weight of the purified enzyme was estimated at 72 kDa by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate. The optimum pH for the enzymatic activity was 6.5 and the enzyme was stable in the pH range of 6.5 to 8.0. The optimum temperature was 65 °C at pH 6.5 and was thermally stable at 55 °C in the absence of substrate for 1 h incubation and stable at 65 ° C in the presence of Ca2+ 5 mmol L -1. The enzyme activity increased in the presence of Ba2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, K+, Zn2+ and was inhibited in the presence of Cu2+, Hg2+, Ag+, Li2+, Al3+ and NH42+ ions and by β, γ -CD, DMSO, Triton, SDS and NaN3. Using maltodextrin as substrate CGTase presented 11.0 ± 0.5 μmol min · mg and 0.30 ± 0.07 mg mL-1, Vmax and Km, respectively. The thermodynamic parameters of CGTase, which demonstrated more than 11 hours at 65 ºC as a half-life, and high structural resistance to thermal denaturation were evaluated when the results of entropy, activation energy and enthalpy were evaluated. 140303/2016-2