Aspectos imunológicos e moleculares correlacionados às manifestações clínicas da Leishmaniose tegumentar americana

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2018. Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença tropical negligenciada causada por protozoários do gênero Leishmania. A transmissão ocorre principalmente pela picada de flebotomíneos fêmeas infectadas. A LTA apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas classificadas como leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose cutânea disseminada (LCDs), leishmaniose cutânea difusa (LCDf) e leishmaniose mucocutânea (LMC). Os mecanismos envolvidos no desenvolvimento e progressão das lesões ainda não estão completamente elucidados, sendo essencial conhecer os fatores que atuam na patogênese da doença e como eles contribuem para a diversidade de apresentações dos sintomas para melhor atendimento e tratamento dos pacientes. Neste trabalho, avaliou-se aspectos imunológicos e moleculares da LTA em indivíduos provenientes de áreas endêmicas do Brasil a fim de se verificar como esses aspectos estão associados às diversas manifestações clínicas da doença. A população do estudo foi composta por 30 pacientes provenientes de Corte de Pedra (Bahia) e 45 pacientes de diversas localidades atendidos no Hospital Universitário de Brasília (HUB) (Distrito Federal). Os indivíduos foram avaliados quanto à sintomatologia, sexo, idade, procedência, carga parasitária, produção de anticorpos e de citocinas. Além disso, foi analisada a influência da diversidade do parasito pela identificação de espécies de Leishmania e foi realizada pesquisa do vírus de RNA de Leishmania (LRV1) nas amostras. Foram coletadas amostras de sangue e de soro de todos os pacientes e biópsias dos indivíduos que apresentavam lesões ativas. A parasitemia foi determinada por qPCR direcionada ao kDNA do parasito e a presença do LRV1 foi avaliada por qRT-PCR e RT-PCR. A identificação das espécies de Leishmania se deu mediante sequenciamento dos produtos de PCR da região espaçadora do gene de RNA ribossomal ITS1. O método sorológico ELISA foi utilizado para a determinação de IgG anti-Leishmania e a citometria de fluxo para a dosagem das citocinas. Dos 75 pacientes avaliados, 23 (31%) pacientes eram assintomáticos, 34 (45%) pacientes apresentaram LCL primária, 10 (13%) pacientes apresentavam LCL recidiva e oito (11%) pacientes apresentavam LMC. O diagnóstico sorológico identificou 60 (80%) casos positivos e foi mais sensível para o grupo assintomático. As citocinas TNF, IFN-y, IL-17A e IL-2 foram diretamente relacionadas a grupos clínicos específicos. As diferenças nas concentrações de citocinas e sua correlação com os grupos clínicos avaliados reforçam a importância do sistema imune do hospedeiro na manifestação dos sintomas. O teste molecular detectou 45 (60%) pacientes positivos, sendo que a maior carga parasitária foi relatada em pacientes de Corte de Pedra com lesão ativa. As espécies L. amazonensis, L. braziliensis e L. guyanensis foram identificadas. Não foi demonstrada diferença estatística significativa na titulação de anticorpos e na carga parasitária entre os indivíduos com diferentes manifestações clínicas, não sendo possível relacionar esses fatores à severidade dos sintomas. Ademais, o LRV1 não foi detectado em nenhuma amostra. Isso nos levou a realizar experimentos in vitro com a finalidade de avaliar a influência do LRV1 na infectividade e na resposta ao tratamento com antimonial pentavalente e anfotericina B. Os resultados indicaram que o LRV1 não altera a taxa de infectividade das espécies de Leishmania, porém sua presença pode estar relacionada à resistência ao tratamento com antimonial pentavalente. Os resultados obtidos corroboram que múltiplos fatores atuam em associações complexas para resultar no amplo espectro sintomático da LTA, contudo é necessária a realização de novos estudos, com número amostral maior, para que se possa expandir o conhecimento acerca desses fatores. American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is a neglected tropical disease caused by protozoa of the genus Leishmania. Transmission occurs mainly by the bite of infected female sandflies. ATL presents a wide spectrum of clinical manifestations classified as cutaneous leishmaniasis (CL), disseminated leishmaniasis (DL), diffuse cutaneous leishmaniasis (DCL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL). The mechanisms involved in the development and progression of the lesions have not yet been fully elucidated and is essential to understand the factors that act in the pathogenesis of the disease and how they contribute to the diversity of presentations of the symptoms for better care and treatment of the patients. In this study, immunological and molecular aspects of ATL were evaluated in individuals from endemic areas of Brazil in order to verify how these aspects are associated with the clinical manifestations of ATL. The study population was 30 patients from Corte de Pedra (Bahia) and 45 patients from different locations attended at the University Hospital of Brasília (UHB) (Federal District). The individuals were evaluated for symptomatology, sex, age, origin, parasite load, production of antibodies and of cytokines. In addition, the influence of parasite diversity on the identification of Leishmania species and Leishmania RNA virus (LRV1) in the samples was analyzed. Blood and serum samples from all patients and biopsies of individuals with active lesions were collected. Parasitemia was determined by qPCR directed to kDNA of the parasite and the presence of LRV1 was evaluated by qRT-PCR and RT-PCR. Identification of the Leishmania species was performed by sequencing the ribosomal RNA gene ITS1. ELISA was used for the determination of anti-Leishmania IgG and flow cytometry for cytokine dosing. Of the 75 patients evaluated, 23 (31%) patients were asymptomatic, 34 (45%) patients had primary CL, 10 (13%) patients had recurrent CL, and eight patients (11%) had MCL. The serological diagnosis identified 60 (80%) positive cases and was more sensitive to the asymptomatic group. TNF, IFN-γ, IL-17A and IL-2 cytokines were directly related to specific clinical groups. Differences in cytokine concentrations and their correlation with the clinical groups evaluated reinforce the importance of the host immune system in the manifestation of symptoms. The molecular test detected 45 (60%) positive patients, and the highest parasite load was reported in patients with cutaneous lesion with active lesion. The species L. amazonensis, L. braziliensis and L. guyanensis were identified. No significant statistical difference was found in antibody titers and parasite load among individuals with different clinical manifestations, and it is not possible to relate these factors to the severity of the symptoms. In addition, LRV1 was not detected in any sample. This led us to conduct in vitro experiments to evaluate the influence of LRV1 on infectivity and response to treatment with pentavalent antimonial and amphotericin B. The results indicated that LRV1 does not change the infectivity rate of Leishmania species, but it is may be related to resistance to pentavalent antimonial treatment. In conclusion, the results obtained corroborate that multiple factors act in complex associations to result in the broad spectrum of symptomatic ATL. It is necessary to carry out new studies, with a larger sample number, so that the knowledge about the factors involved in the pathogenesis of the disease can be expanded.