Impacts of using s-adenosyl-l-homocysteine in bovine cell culture system

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Animais, 2012. Fatores epigenéticos são responsáveis por controlar a expressão de genes e diferenciação durante a vida celular. Dentre eles, a metilação do DNA é o mais estudado. Cada tipo celular possui um padrão epigenético altamente especializado. Após a fecundação natural ou clonagem por transferência nuclear (TNCS), um padrão epigenético préexistente deve ser apagado e restabelecido para garantir o correto desenvolvimento embrionário. Porém, nos clones, essa reprogramação é ineficiente mas é possível que o uso de substâncias desmetilantes de DNA utilizadas durante o cultivo celular de células doadoras de núcleo possa desmetilar o DNA, aumentando a eficiência da técnica. O objetivo desse estudo foi avaliar, em fibroblastos bovinos, o efeito da S-Adenosil-L-Homocisteína (SAH) na viabilidade celular, metilação de DNA e expressão do transcrito específico do gene XIST responsável pela inativação do cromossomo X. Células foram cultivadas em meio de cultivo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium -Gibco®), suplementado com 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM de SAH (Sigma®), incubado a 39°C e 5% de CO2. O padrão de metilação do DNA foi avaliado através do sequenciamento de sequências de DNA tratadas com bissulfito de sódio, usando o kit EZ DNA methylation Kit™ (ZymoResearch®), para converter citosinas não metiladas. O RNA total das células foi extraído com o kit RNeasy Plus Micro kit (Qiagen®) e o transcrito de XIST foi quantificado por PCR em tempo real, usando GAPDH e CYC-A como controles endógenos. O número de células foi comparado entre o grupo controle e os grupos tratados com 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM de SAH e a metilação do DNA e a expressão entre o grupo controle e o grupo tratado com 2.0mM de SAH. Não houve diferença na viabilidade celular, metilação de DNA e expressão gênica entre os tratamentos. O grupo controle apresentou 100% de sequências hipermetiladas e 87,58% de metilação e o grupo tratado com 2.0mM de SAH apresentou 92,86% de sequências hipermetiladas e 82,35% de metilação. O uso do SAH como agente desmetilante no cultivo celular é uma alternativa viável que continua sendo estudada. Acredita-se que um processo de desmetilação é induzido pelo uso do SAH durante o cultivo celular, contribuindo para o aumento da eficiência da TNCS. Contudo, é necessário avaliar outras concentrações e diferentes tempos de cultivo com o SAH. _______________________________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT Epigenetic factors are responsible for controlling gene expression and differentiation through the cell life. Among them, DNA methylation is the most studied. Each cell type possesses a specific and highly specialized epigenetic pattern. After natural fertilization or cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT), a pre-existing epigenetic pattern must be erased and reestablished to ensure correct embryo development. However, in cloning this reprogramming is inefficient and it is possible that the use of a DNA demethylating substance can improve the efficiency of the technique. The aim of this study was to evaluate, in bovine skin fibroblasts, the effects of S-(5’-adenosyl)-L-homocysteine (SAH) on cell viability, DNA methylation and expression of the X-inactive specific transcript (XIST) gene. Cells were cultivated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco®) supplemented with 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM of SAH (Sigma ®) incubated at 39°C with 5% CO2 in air. The pattern of DNA methylation was assessed by bisulfite sequencing, using the EZ DNA methylation Kit™ (ZymoResearch®) to convert unmethylated cytosines. Total RNA was extracted with the RNeasy Plus Micro kit (Qiagen®) and the XIST transcript was quantified by qPCR using GAPDH and CYC-A as endogenous controls. The number of cells was compared among 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM of SAH and control groups and DNA methylation and gene expression between control and 2.0mM groups. There were no differences in cell viability, DNA methylation and gene expression among treatments. Control group showed 100% of hypermethylated sequences and 87.58% of methylation and the 2.0mM group showed 92.86% of hypermethylated sequences and 82.35% of methylation.The use of SAH as a DNA demethylating agent in cell culture is a viable alternative and still little studied. It is believed that a demethylation process is induced by the useof SAH in the culture, contributing to increase the efficiency of SCNT. However, it is necessary to evaluate other concentrations and different times of cultivation with SAH.