Functional validation of microRNA target genes in hepatocellular carcinoma

Submitted by Carolina Fazio Campos (carolina.fazio@unesp.br) on 2020-09-25T22:24:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Carolina Fazio Campos.pdf: 5252674 bytes, checksum: 20e7b16b0195219fbfd66c9c1211a91f (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-09-28T13:53:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 campos_cf_me_bot_par.pdf: 1864498 bytes, checksum: 0252991a7925eb6f1f741614885f5e1c (MD5) Made available in DSpace on 2020-09-28T13:53:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 campos_cf_me_bot_par.pdf: 1864498 bytes, checksum: 0252991a7925eb6f1f741614885f5e1c (MD5) Previous issue date: 2020-08-26 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Introdução: miRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas que regulam a expressão gênica associada a diversos mecanismos biológicos. Os miRNAs têm sido indicados como potenciais biomarcadores para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de diversos tipos de câncer, incluindo o carcinoma hepatocelular (CHC). CHC é a quarta causa mais comum de morte por câncer e é frequentemente associado com mau prognóstico, agressividade, resistente a medicamentos e diagnostico avançado. Objetivo: Identificar e validar experimentalmente a interação entre miRNA/genes-alvo relacionados com o processo de tumorigênese do CHC e contribuir para a identificação de vias moleculares relevantes para o desenvolvimento tumoral. Além disso, verificar o efeito da alteração da expressão do miRNA escolhido sobre o potencial de proliferação, migração e invasão celular nas linhagens de CHC. Material e Métodos: A seleção do miRNA foi feita a partir de dados anteriores do grupo e análises de bioinformática. A identificação dos genes-alvo foi realizada por meio de ferramentas de predição computacional (mirDIP e miRTarBase). As linhagens celulares de câncer de CHC (Hep 3B e PCL/PRF/5) foram transfectadas com o mimético do miRNA selecionado, ou o seu controle negativo, a fim de avaliarmos a expressão dos genes-alvo (RT-qPCR). Após a transfecção, foi avaliado o potencial de proliferação celular (MTS), migração (wound healing) e invasão (ensaio transwell) das linhagens. Ensaio da Luciferase foi utilizado para confirmar a ligação do miRNA ao gene-alvo. Resultados: O miR-451a foi selecionado para a validação funcional por apresentar consistentemente diminuição de expressão em CHC de três bancos de dados (tumores primários de pacientes, meta-análise e TCGA). Análise in silico revelou 12 possíveis genes candidatos regulados pelo miR-451a relevantes na tumorigênese e ainda não validados experimentalmente: FMNL3, BUB1B, SPC25, KIF2A, PLEKHG2, BAK1, HMGB2, MEF2D, CDKN2B, HELLS, RRAGD, CSE1L. Nas duas linhagens celulares, o aumento da expressão do miR-451a após transfecção com miRNA mimético resultou na diminuição significativa (p