Análisis del efecto de la α-Solanina en las características citomorfológicas de células vivas adheridas y su relación con la expresión del gen Shroom3

Dado el actual interés de diferentes investigadores hacia la α-solanina como potencial sustancia anticancerígena y la controversia que existe en la literatura científica sobre la posible citotoxicidad de la α-Solanina, así como las alteraciones que la sustancia provoca sobre diferentes células, se consideró de gran interés analizar los efectos que el glicoalcaloide produce en Células Troncales de Medula Ósea (CTMO). Con este fin se propuso la siguiente hipótesis de investigación; La observación y análisis de los cambios morfológicos resultado de la exposición de las CTMO a diferentes concentraciones y tiempos, permitirá proponer un modelo reproducible y unos patrones de comparación cualitativa que permitan analizar cambios de citotoxicidad básica mediante microscopia óptica en células vivas en cultivo. Este trabajo se realizó cumpliendo tres niveles de resolución: el primero, resolución macro, que corresponde a presentar la importancia de la α-solanina para la salud humana y expone la importancia de su análisis (Artículo publicado). En segundo lugar, resuelve dos problemas con los que nos enfrentamos al examinar el efecto morfológico que ocasiona el glicoalcaloide en este tipo de células mesenquimales inmunotipificadas, vivas y adheridas. Por un lado, no estaba descrita una técnica colorimétrica sencilla que permitiera visualizar en células vivas adheridas el efecto producido por el glicoalcaloide y por otro la ausencia en la literatura revisada, de la descripción de los rangos no letales, de concentración y tiempo de exposición al glicoalcaloide. Por estas razones se propuso validar la utilización de la tinta china como alternativa directa, nítida, económica y viable en el análisis del efecto ocasionado por la exposición de las células troncales de medula ósea de rata (CTMO) a dos concentraciones del glicoalcaloide, contenidas entre los rangos de experimentación resultado del análisis de referencias bibliográficas. (Artículo publicado). Por otro lado, no había evidencia en la literatura de las concentraciones del glicoalcaloide que permitieran evidenciar en este tipo de células mesenquimales, cambios morfológicos básicos ; 1. Cambios de forma de las células (Homogeneidad y Heterogeneidad celular predominante), 2. Cambios en tamaño y condensación intracitoplasmática, 3. Visualización o no de la membrana celular, 4. Presencia de prolongaciones o espículas modificadas en número y longitud, 5. Características de Núcleos, 6. Número de Nucléolos y 7. Presencia o no de vacuolas intracitoplasmáticas. (Artículo Publicado). Los cambios morfológicos evidenciados con la técnica propuesta y a las concentraciones sugeridas, fueron entonces validados en células vivas adheridas mediante la observación de la proteína globular actina, por medio de microscopia confocal y en células no adheridas, por medio del análisis de viabilidad (MTS-utilizando espectrofotometría), proliferación (CFSE) y apoptosis (Anexina V/7AAD) utilizando Citometría de Flujo. Los resultados demostraron que la α- Solanina produce cambios morfológicos visibles en microscopia convencional mayormente en las células tratadas durante 24 h con α- Solanina a una concentración de 2 μM, modificando parámetros relacionados con citotoxicidad basal, como forma, tamaño y longitud de espículas (Artículo Sometido) , así como también produciendo efectos característicos en núcleo, efectos característicos en la distribución de los microfilamentos de actina e inhibiendo la proliferación celular, promoviendo la apoptosis, y la autofagia (Artículo en revisión). Para el tercer nivel de resolución, se propuso el análisis de la posible relación entre el glicoalcaloide α-solanina y la expresión del gen Shroom3 descrito como regulador de la morfología celular en más de veinte tipos celulares incluidas las mesenquimales. Para esto, se expusieron células troncales de medula ósea de rata a dos concentraciones diferentes del glicoalcaloide y se realizó extracción de ARN y reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR). Los resultados obtenidos en esta parte del trabajo proponen un vínculo entre el gen Shroom3 y la exposición a la α-Solanina, debido a que se encontró que el glicoalcaloide regula negativamente la expresión del gen de una manera dependiente de la concentración y del tiempo. En todos los niveles de resolución del trabajo se utilizaron células troncales de medula ósea de rata hembra cepa Lewis entre 2 y 4 meses de edad de la cepa Lewis alojadas en la Sala de Experimentación Animal de la Facultad de Odontología de Pontificia Universidad Javeriana. Estas células fueron obtenidas, extraídas, inmunotipificadas, caracterizadas y cultivadas en el Centro de Investigaciones Odontológicas bajo sus propios protocolos (en proceso de publicación según sus investigadores Jaramillo L., Duran C.). La α-solanina fue obtenida comercialmente. Pontificia Universidad Javeriana Given the current interest of different researchers towards α-solanine as a potential anti-cancer substance and the controversy that exists in the scientific literature about the possible cytotoxicity of α-Solanine, as well as the alterations that the substance causes on different cells, it was considered great interest to analyze the effects that the glycoalkaloid produces in Bone Marrow Truncal Cells (CTMO). To this end, the following research hypothesis was proposed; The observation and analysis of the morphological changes resulting from the exposure of the CTMO at different concentrations and times, will allow to propose a reproducible model and qualitative comparison patterns that allow to analyze changes of basic cytotoxicity by optical microscopy in living cells in culture. This work consider three levels of resolution: the first, macro resolution, which corresponds to presenting the importance of α-solanine for human health and exposes the importance of its analysis (Article published).Secondly, it solves two problems that we face when we examine the morphological effect caused by the glycoalkaloid in this type of immunotyped, alive and adherent mesenchymal cells. On the one hand, a simple colorimetric technique was not described that allowed to visualize in live adhered cells the effect produced by the glycoalkaloid and on the other hand the absence in the reviewed literature, of the description of the non-lethal ranges, of concentration and time of exposure to the glycoalkaloid. For these reasons it was proposed to validate the use of Chinese ink as a direct, clear, economical and viable alternative in the analysis of the effect caused by the exposure of rat bone marrow stem cells (CTMO) to two concentrations of glycoalkaloid, contained between the ranges of experimentation resulting from the analysis of bibliographic references. (Article published). On the other hand, there was no evidence in the literature of the concentrations of the glycoalkaloid that allowed to show in this type of mesenchymal cells, basic morphological changes; We observe 1. Changes in the shape of the cells (Homogeneity and predominant cellular heterogeneity), 2. Changes in size and intracytoplasmic condensation, 3. Visualization or not of the cell membrane, 4. Presence of prolongations or spicules modified in number and length, 5. Characteristics of Nuclei, 6. Number of Nucleoli and 7. Presence or not of intracytoplasmic vacuoles. (Article Published). The morphological changes evidenced with the proposed technique and the suggested concentrations were then validated in living adhered cells by observing the globular actin protein, by means of confocal microscopy and in non-adherent cells, by means of viability analysis (MTS-using spectrophotometry), proliferation (CFSE) and apoptosis (Annexin V / 7AAD) using Flow Cytometry. The results showed that α-Solanine produces visible morphological changes in conventional microscopy. Mainly in cells treated for 24 h with α-Solanine at a concentration of 2 μM, modifying parameters related to basal cytotoxicity, such as shape, size and length of spicules ( Submitted Article), as well as producing characteristic effects in nucleus, characteristic effects in the distribution of actin microfilaments and inhibiting cell proliferation, promoting apoptosis, and autophagy (Article under review). For the third level of resolution, we proposed the analysis of the possible relationship between the glycoalkaloid α-solanine and the expression of the Shroom3 gene described as a regulator of cell morphology in more than twenty cell types including mesenchymal. For this, we expose rat bone marrow to two different glycoalkaloid concentrations and we do RNA (qRT-PCR). The results obtained in this part of the work propose a link between the Shroom3 gene and exposure to α-Solanine, because found that the glycoalkaloid negatively regulates the expression of the gene in a manner dependent on concentration and time. At all levels of resolution we used stem cells of bone rat marrow female Lewis strain between 2 and 4 months of age of the Lewis strain housed in the Animal Experimentation Room of the Faculty of Dentistry of Pontificia Universidad Javeriana. These cells were obtained, extracted, immunotyped, characterized and cultured in the Dental Research Center under their own protocols (in publication process according to their researchers Jaramillo L., Duran C.). α-Solanine was obtained commercially. Doctor en Ciencias Biológicas Doctorado