Papel dos receptores TRPA1 e TRPV1 em modelos de crises epilépticas

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A epilepsia é um distúrbio neurológico que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, enquanto a epilepsia do lobo temporal (ELT) responde por 40% de todos os casos de epilepsia, sendo a forma mais comum em adultos. A família de receptores de potencial transiente (TRP) é um grupo de canais catiônicos envolvidos em diferentes processos fisiológicos, como a homeostase iônica. O acúmulo de cálcio nos neurônios do hipocampo tem sido associado à etiologia da epilepsia, o que motiva o estudo da família TRP, cujos canais são altamente permeáveis a esse íon. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos dos bloqueadores TRPA1 e TRPV1 nas crises epilépticas, alterações histológicas e bioquímicas, além da liberação de glutamato e do conteúdo de cálcio citosólico em modelo de crise epiléptica induzida por pilocarpina ou pentilenotetrazol ou em preparações sinaptossomais de córtex. Para isso, animais C57Bl/6 (8-12 semanas de idade) receberam injeção intra-hipocampal de pilocarpina (40 μg), 30 minutos após a injeção intraperitoneal de bloqueador de TRPA1, TRPV1 ou veículo. Os bloqueadores do receptor TRPA1, AP18 (1, 3 e 10 mg/Kg) e do receptor TRPV1, SB366791 (0,1; 0,3 e 1 mg/Kg) foram utilizados nos experimentos in vivo. As concentrações de 0,1; 1; 10 e 30 μM foram usadas nas preparações de sinaptossomas para ambos os bloqueadores. Vinte e quatro horas após o status epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina, os animais foram eutanasiados para a coleta dos tecidos cerebrais. Metade de seus cérebros foram removidos e processados para posteriores análises histológicas para avaliação de morte e viabilidade neuronal, marcação microglial e astrocitária. A outra metade dos cérebros dos animais foi removida para posterior análise de BDNF e dos níveis de citocinas, além da ativação da proteína quinase B (Akt) e da quinase regulada por sinal extracelular (Erk). As crises epilépticas induzidas pela pilocarpina foram avaliadas de acordo com a escala de Racine. Foi revelada forte associação entre AP18 e o desenvolvimento de SE, bem como o bloqueador e crises tônicoclônicas. O AP18 (3 mg/Kg) aumentou as crises classificadas como 3, 4 e 5. Por outro lado, o AP18 (10 mg/Kg) aumentou a latência mediana para os animais desenvolverem SE em relação ao grupo pilocarpina. A pilocarpina aumentou a marcação de neurônios em processo de degeneração evidenciada pela marcação por Fluoro-Jade C (FJC), sendo esta exacerbada pela administração de AP18 (1 e 3 mg/kg). De forma surpreendente, a droga induziu uma resposta dicotômica na microgliose induzida pela pilocarpina, pois exacerbou este parâmetro no giro denteado (GD) (3 mg/Kg) e reduziu em CA1 (1 e 3 mg/Kg). Observamos uma redução na reatividade astrocitária com AP18 (1 e 10 mg/Kg) induzida por pilocarpina, enquanto a dose de 3 mg/Kg de AP18 aumentou essa marcação no GD. Além disso, o AP18 reduziu os níveis de BDNF, TNF-α e CX3CL1 e aumentou os níveis de IL-10 comparado ao grupo pilocarpina. Em relação ao receptor TRPV1, foi observada forte associação entre SB366791 e o desenvolvimento do SE. A frequência de SE e convulsões tônico-clônicas no grupo SB366791 (0,1 e 0,3 mg/Kg) foi maior do que no grupo pilocarpina. A crise comportamental foi acompanhada por um aumento da morte neuronal. AP18 e SB366791 não alteraram nenhuma das análises com preparações de sinaptossomas corticais. Finalmente, nas crises induzidas por pentilenotetrazol, AP18 e SB366791 não alteraram a latência para o desenvolvimento de SE. O presente estudo mostrou que a administração sistêmica dos bloqueadores de TRPA1 e TRPV1, AP18 ou SB366791, respectivamente, aumentou a gravidade das crises epilépticas e danos neuronais decorrentes do SE induzido pela injeção intra-hipocampal de pilocarpina. Nossos resultados sugerem que AP18 e SB366791 apresentam efeitos pró-convulsivantes no modelo de pilocarpina, mas não de pentilenotetrazol. Estudos complementares nos ajudarão a caracterizar os mecanismos subjacentes desses canais na ELT. Epilepsy is a neurological disorder that affects millions of people around the world, while temporal lobe epilepsy (ELT) accounts for 40% of all epilepsy cases, being the most common form in adults. The family of transient potential receptors (TRP) are a group of cation channels involved in different physiological processes, such as ion homeostasis. Calcium accumulation in the neurons of the hippocampus has been associated with the etiology of epilepsy, which motivates the study of the TRP family, whose channels are highly permeable to this ion. The aim of this study was to evaluate the effects of TRPA1 and TRPV1 blockers on seizures, histological, and biochemical changes, besides glutamate release and cytosolic calcium content in model of pilocarpine or pentylenetetrazole -induced seizures or in cortex synaptosomal preparations. For this, C57Bl/6 animals (8-12 weeks of age) received intrahippocampal pilocarpine injection (40 μg), 30 minutes after intraperitoneal injection of TRPA1, TRPV1 blocker or vehicle. Blockers of the TRPA1, AP18 receptor (1, 3 and 10 mg/Kg) and TRPV1 receptor, SB366791 (0.1; 0.3 and 1 mg/Kg) were used in the in vivo experiments. Concentrations of 0.1; 1; 10 and 30 μM were used in the preparation of synaptosomes for both blockers. Twenty-four hours after pilocarpine-induced status epilepticus (SE), animals were euthanized to collect brain tissues. Half of their brains were removed and processed, for further histological techniques to evaluate neuronal death and viability, microglia and astrocyte staining. The other half of the animal’s brains were removed for further analysis of BDNF and cytokines levels, besides the protein kinase B (Akt) and extracellular-signal-regulated kinase (Erk) activation. The seizures induced by pilocarpine were evaluated according to Racine’s scale of seizures. Strong association between AP18 and the development of SE was revealed, as well as the blocker and tonic-clonic seizures. AP18 (3 mg/Kg) increased the seizures classified as 3, 4 and 5. On the other hand, AP18 (10 mg/Kg) increased the median latency for the animals to develop the SE as compared with pilocarpine group. Pilocarpine increased the labeling of neurons in the degeneration process evidenced by Fluoro-Jade C (FJC) staining, which was exacerbated by the administration of AP18 (1 and 3 mg/kg). Surprisingly, the drug induced a dichotomous response in microgliosis induced by pilocarpine, as it exacerbated in dentate gyrus (DG) with AP18 (3 mg/kg) and decreased in CA1 with doses of 1 and 3 mg/kg of AP18. We observed a reduction in astrocyte reactivity with AP18 (1 and 10 mg/kg) induced by pilocarpine, while the dose of 3 mg/kg of AP18 increased this marking in DG. In addition, AP18 reduced the levels of BDNF, TNF-α and CX3CL1, and enhanced IL-10 levels compared to the pilocarpine group. In relation to TRPV1, strong association was observed between SB366791 and the development of the SE. The frequency of SE and tonic-clonic seizures in the SB366791 group (0.1 and 0.3 mg/Kg) was higher than the pilocarpine group. The behavioral seizure was accompanied by an enhancement of neuronal death. AP18 and SB366791 did not change any of the analysis with cortical synaptosomes preparations. Finally, in the pentylenetetrazole-induced seizures AP18 and SB366791 did not change the latency for SE development. The present study showed that the systemic administration of the TRPA1 and TRPV1 blockers, AP18 or SB366791, respectively, increased the severity of epileptic seizures and neuronal damage resulting from the SE induced by the intra-hippocampal injection of pilocarpine. Our results suggested that AP18 and SB366791 show pro-convulsive effects in the pilocarpine model, but not in pentylenetetrazole- induced seizures. Further studies will allow the characterization of the underlying mechanisms of these channels in TLE.