Effects of cAMP/PKA pathway modulation and T3 absence on oligodendroglia in vitro: formation and maintenance of oligodendroglial processes and distribution of oligodendrocytes/myelin proteins and RhoA

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T20:54:53Z No. of bitstreams: 1 Luiz Otavio Ribeiro de Lemos Felgueiras Tese completa.pdf: 3421501 bytes, checksum: 3696a42b49cc09e57d656073e8f47a69 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T20:54:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Otavio Ribeiro de Lemos Felgueiras Tese completa.pdf: 3421501 bytes, checksum: 3696a42b49cc09e57d656073e8f47a69 (MD5) Previous issue date: 2016-08-26 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro The importance of thyroid hormone (T3) in oligodendroglial differentiation, its relationship with cytoskeleton proteins and its role in myelin proteins distribution such as CNPase and MBP had already been showed. We have also showed that MAPK/ERK pathway has a role in oligodendrocyte processes elongation and branching. The cAMP/PKA pathway may be also relevant for oligodendroglial morphology. PKA can also be important to the process elongation because can inhibit RhoA and consequently its increase. In this study we aimed to evaluate the relationship between T3 and cAMP/PKA signaling on CNPase, MAG and RhoA distribution, oligodendroglial development and morphology, in vitro. Oligodendroglial cells were obtained from cerebral hemispheres of newborn rats and cultured with or without T3 (T3 or T3) in the medium. After 5 days these two groups were divided accordingly to each drug treatment: DMSO (control); an adenylyl cyclase activator forskolin (FORSC) [10 mM]; an adenylyl cyclase inhibitor SQ22356 (SQ) [1 mM]; an inhibitor of PKA, H-89 [1 mM] and both forskolin [10 mM] and H-89 [1 mM] (FORSC+H-89). Treatment effects were observed at 30min or at 24h. With 24h of treatment with H-89 progenitors´s (OPCs) percentage was reduced and the treatment with FORSC or FORSC+H-89 for 30min reduced the percentage of OPCs with processes above the media. Absence of T3 reduced the percentage of OPCs with processes above the media in cultures with 5 div but FORSC or SQ´s treatments with 30 min reverted these effects. Treatment during 30min or 24h did not change pre-oligodendrocyte´s (POs) percentage in the presence of T3 but the treatment with FORSC during 24h changed the percentage of POs with processes above the media. Treatment with FORSC, H-89 or both together for 30min reduced the percentage of POs above the media in the absence of T3. FORSC enhanced immature´s (IO) percentage and the absence of T3 reduced the percentage of IO with processes above the media, these effects were prevented with SQ and H-89´s treatments. In mature cells all treatments affected the percentage of cells above the median and FORSC could revert the effects of T3 absence. The results corroborated T3´s participation on CNPase and MAG distribution and that FORSC can reverts the effects of T3 absence. H-89 treatments concentrated RhoA in the nucleus of cells with 5 div. Our results reinforce the importance of T3 in late stages of oligodendroglia differentiation as well as in the formation and maintenance of cells processes. Besides suggests that cAMP/PKA pathway is important for processes formation and can interfere in the T3´s absence effects. Já foi demonstrada em trabalhos anteriores de nosso laboratório a importância do hormônio tireoidiano (T3) na diferenciação da oligodendroglia, sua relação com as proteínas de citoesqueleto e seu papel na distribuição das proteínas de mielina como CNPase e MBP. Já demonstramos também que a via da MAPK/ERK participa do crescimento e arborização dos prolongamentos da oligodendroglia, sendo importante para sua morfologia. A PKA também pode ser importante para a extensão dos prolongamentos uma vez que pode inibir a RhoA e consequentemente aumentar o comprimento dos prolongamentos. Neste estudo buscamos avaliar a relação entre T3 e a sinalização da via do AMPc/PKA na distribuição da CNPase, MAG e RhoA, no desenvolvimento da oligodendroglia e na sua morfologia. A oligodendroglia foi obtida de hemisférios cerebrais de ratos neonatos e cultivada na presença ou ausência de T3 (T3 ou -T3). Após 5 dias os dois grupos foram divididos de acordo com os tratamentos realizados com cada fármaco: DMSO (controle); ativador da adenilato ciclase forscolina (FORSC) [10 mM]; inibidor da adenilato ciclase SQ22356 (SQ) [1 mM]; inibidor da PKA H-89 [1 mM] e ambos forscolina [10 mM] e H-89 [1 mM] (FORSC+H-89). Os efeitos dos tratamentos foram observados após 30min ou 24h. Com 24h de tratamento com H-89 a porcentagem de progenitores de oligodendrócitos (OPCs) reduziu e o tratamento com FORSC ou FORSC+H-89 por 30min reduziu a porcentagem de OPCs com prolongamentos acima da média. A ausência de T3 reduziu a porcentagem de OPCs com prolongamentos acima da média nas culturas com 5 div, mas o tratamento com FORSC ou SQ por 30min reverteu esses efeitos. Os tratamentos na presença de T3 não interferiram na porcentagem de pré oligodendrócitos (POs), mas o tratamento com FORSC por 24H alterou a porcentagem de POs com prolongamentos acima da média. Os tratamentos com FORSC, H-89 ou ambos durante 30min reduziu esta porcentagem na ausência de T3. FORSC elevou a porcentagem de oligodendrócitos imaturos (IO) e a ausência de T3 reduziu a porcentagem de IO com prolongamentos superiores à média, esses efeitos foram prevenidos com os tratamentos com SQ e H-89. Nas células maduras todos os tratamentos afetaram a porcentagem de células com prolongamentos acima da mediana e o tratamento com FORSC pode reverter os efeitos da ausência de T3. O tratamento com H-89 concentra a RhoA no núcleo das células com 5 div. Os resultados reforçam a importância do T3 em estágios tardios de diferenciação da oligodendroglia, assim como na formação e manutenção dos prolongamentos. Além disso, sugerem que a via do AMPc/PKA é importante para a formação dos prolongamentos e é capaz de interferir nos efeitos da ausência de T3.