Produção e caracterização de quitooligossacarídeos, avaliação da sua toxicidade aguda e ação cicatrizante

A integridade da pele é essencial para a vida humana. Quando ocorre uma ruptura nessa barreira física, o intuito do mecanismo de reparo é induzir uma resposta rápida e eficiente para evitar complicações como a formação de queloides ou evolução para uma ferida crônica. Dessa forma, a demanda pela busca de substâncias, que possam auxiliar o processo de cicatrização, tem aumentado de maneira acelerada. Nesse cenário, os quitooligossacarídeos (QOS) são biomoléculas promissoras, com ação anti-inflamatória e imunoestimulante atestadas na literatura, que podem contribuir para o mecanismo biológico de reparo. Diante disso, esse estudo apresenta como objetivo produzir QOS, em dois tempos de hidrólise (1 e 5 minutos) por quitosanases derivadas de Bacillus toyonensis, realizar sua caracterização estrutural, avaliar sua biocompatibilidade, em modelos de toxicidade aguda in vivo e citotoxidade, e sua ação cicatrizante nos modelos de migração celular (“scratch”) in vitro e no de reparo de feridas in vivo. O processo de degradação enzimática da quitosana produziu oligossacarídeos com a presença de hexâmeros indicada através da técnica de cromatografia de permeação em gel (CPG) e comprovada na análise de espectrometria de massas. O ensaio de toxicidade aguda confirmou a não toxicidade dessas substâncias e o de citotoxicidade indicou a biocompatibilidade desses oligossacarídeos sobre fibroblastos murinos. A capacidade dos QOS em estimular a migração de fibroblastos in vitro foi observada em todas as concentrações testadas (100; 250; 500 µg/mL), com uma redução de até 100% no tamanho da ranhura após 12 horas da adição da concentração de 500 µg/mL de QOS produzidos com 5 minutos de hidrólise. O efeito cicatrizante in vivo desses oligossacarídeos foi confirmado no modelo da ferida induzida por corte cirúrgico, onde essas moléculas apresentaram redução significativa para os grupos testados com QOS1 30 mg/kg (89,25% ± 2,2), QOS1 300 mg/kg (82% ± 10,6), QOS5 30 mg/kg (89,25% ± 1,7) e QOS5 300 mg/kg (93% ± 0,8) quando comparados ao grupo salina (61,25% ± 8,1) no sétimo dia de experimento. Apesar de não possuir mecanismo de ação conhecido, a presença de hexâmeros pode estar relacionada com os efeitos biológicos dos QOS. Dessa forma, os resultados obtidos indicam o potencial uso como cicatrizante dos QOS para o âmbito farmacêutico. The skin integrity is essential for human life. When a rupture occurs in this physical barrier, the purpose of the repair mechanism is to induce a quick and efficient response to avoid complications such as keloid formation or progression to a chronic wound. Thus, the demand for the substances search that can help the healing process has increased rapidly. In this scenario, chitooligosaccharides (COS) are promising biomolecules, with anti-inflammatory and immunostimulating action attested in the literature, which may contribute to the biological repair mechanism. Therefore, this study aims to produce COS, in two times of hydrolysis (1 and 5 minutes) by chitosanases derived from Bacillus toyonensis, to carry out structural characterization, to evaluate biocompatibility in acute toxicity models in vivo and cytotoxicity, and healing action in cell migration models (“scratch”) in vitro and in vivo wound repair. The chitosan enzymatic degradation process produced oligosaccharides with hexamers predominance attributed through the gel permeation technique chromatography (GPC) and proven in the analysis mass spectrometry. The acute toxicity test confirms the nontoxicity of these substances and cytotoxicity indicates the oligosaccharides biocompatibility on murine fibroblasts. The COS ability to stimulate fibroblast migration in vitro was observed in all tested tools (100; 250; 500 µg/mL), with a reduction up to 100% in the groove size 12 hours after adding a concentration of 500 µg/mL COS obtained with 5 minutes hydrolysis. The oligosaccharides in vivo healing effect was confirmed in the surgical wound-induced model, where these molecules reduced for the groups tested with COS1 30 mg/kg (89.25% ± 2.2), COS1 300 mg/kg (82% ± 10.6), COS5 30 mg/kg (89.25% ± 1.7) and COS5 300 mg/kg (93% ± 0.8) when compared to saline group (61.25% ± 8.1) on the seventh day of the experiment. Despite having no known mechanism of action, the hexamers presence may be related to the COS biological effects. Thus, the selected results indicate the COS potential use as a healing for the pharmaceutical field.