Sondas luminescentes aplicadas na identificação de carboidratos e glicoproteínas em tecidos mamários

CAPES Introdução: A imunohistoquímica (IHQ) é a técnica mais empregada para subtipagem molecular do câncer de mama. Embora suas análises sejam de grande utilidade, o método está sujeito à subjetividade e dependência de variáveis pré-analíticas. Assim, recursos mais precisos e concretos permitiriam maior aperfeiçoamento a esses ensaios. Estudos histoquímicos têm mostrado que alterações quantitativas e qualitativas são observadas em glicoconjugados da superfície celular durante o processo neoplásico. Biomoléculas conjugadas a marcadores luminescentes podem funcionar como sondas luminescentes possibilitando elevar a sensibilidade das análises. Objetivos: Este trabalho teve como objetivo conjugar marcadores luminescentes a lectinas e/ou anticorpos e propor como potenciais sondas luminescentes em histoquímica com lectinas e imunohistoquímica de tumores mamários. Metodologia: Conjugados de lectinas (Con A e UEA-I) com criptato de Eu³⁺ (Crip(Eu³⁺)), foram sintetizados, caracterizados através da atividade hemaglutinante (AH), dicroísmo circular (CD) e espectrofluorimetria; e avaliados como sondas luminescentes em histoquímica com lectinas (HqL) para tecidos mamários humanos normal e transformado (fibroadenoma, FIB e carcinoma ductal invasivo, CDI). Anticorpos anti-uPAR, anti-GP88 e anti-MUC1 foram conjugados ao éster de acridina (EA) e empregadas em imunohistoquímica para tecidos mamários com CDI e normal. Resultados: O conjugado UEA-I-Crip(Eu³⁺) preservou AH e manutenção da estrutura da lectina determinada por DC. Con A-Crip(Eu³⁺) apresentou redução da AH e alteração não significativa em DC. Após conjugação com as lectinas, o Crip(Eu³⁺) manteve sua capacidade de luminescência. A HqL com as sondas lectina-Crip(Eu³⁺) revelou diferenças de marcação entre os tecidos normal e transformados avaliados e equivalentes àquelas resultantes do uso de conjugados lectina-FITC (disponíveis comercialmente). A conjugação dos anticorpos (anti-uPAR, anti-MUC I e anti-GP88) com EA permitiu o reconhecimento de seus respectivos alvos possibilitando sua utilização na IHQ luminescente na qual anti-MUC1-EA demonstrou variação do perfil de expressão de MUC1 em tecido mamário normal e CDI expressa em URL (unidades relativas de luz). Conclusão: as sondas luminescentes, conjugados lectina-Crip(Eu³⁺) se apresentam como potenciais ferramentas na HqL agregando a vantagem de serem fotoestável. Na IHQ luminescente as sondas anticorpos-EA permitem a quantificação da marcação podendo ser aliada à análise ótica para diminuição da subjetividade no diagnóstico inerente a metodologias qualitativas. Background: Immunohistochemistry (IHC) is the most commonly used technique for molecular subtyping of breast cancer. Although their analyzes are very useful, the method is subject to subjectivity and dependence of pre-analytical variables. Thus, more precise and specific resources would allow further improvement to these trials. Histochemical studies have shown that quantitative and qualitative changes are observed in cell surface glycoconjugates during neoplastic process. Biomolecules conjugated to luminescent markers can function as luminescent probes decreasing the subjectivity of tissue analysis and allowing its quantification. Objectives: This study aimed to conjugate, characterize, evaluate and aplly lectins and/or antibodies to luminescent markers as potential luminescent probes in lectin histochemistry (LHC) and immunohistochemistry of human mammary tissues. Methodology: Lectin (Ulex europeus agglutinin I, UEA-I and Canavalia ensiformis, Concanavalin A, Con A) and Eu³⁺ criptate conjugates were synthesized, characterized via haemaglutinating activity (HA), circular dicroism (CD) and spectrofluorimetry; and evaluated as luminescent probes in LHC to normal and transformed (fibroadenoma, FIB and invasive ductal carcinoma, IDC) human mammary tissues. Antibodies (anti-uPAR, anti-GP88 and anti-MUC I) were conjugated to Acridinum ester (AE) and used in IHC to normal and IDC human breast tissues. Results: UEA-I-Crip(Eu³⁺) conjugate preserved its HÁ and the lectin structure determined via CD while Con A-Crip(Eu³⁺) presented a decrease in the HA and small change in lectin structure. Both conjugates kept their luminescence. LHC with these probes showed different emissions among breast tissues evaluated (normal and with FIB and IDC) and they were equivalent to the results using the same lectins conjugated to FITC (commercially available). Antibodies (anti-uPAR, anti-MUC I and anti-GP88) conjugated to AE allowed the recognition of their respective targets enabling their use in the luminescent IHC in which anti-MUC1-EA demonstred variation in MUC1 expression profile between normal and IDC breast tissues, expressed in relative light units (RLU). Conclusions: Lectins-Crip(Eu³⁺) probes showed to be potential tools in LHC with the advantage of photostability. Luminescent IHC with antibodies-AE probes allowed to quantify the different staining being an allied to the optical analysis since decreases the subjectivity in the diagnostic and prognostic using qualitative methods.