Oxydation des flavonoïdes dans les graines d'Arabidopsis thaliana. Analyse fonctionnelle du gène TRANSPARENT TESTA 10 codant une polyphénoloxydase de type laccase

Arabidopsis seeds accumulate flavonoids (proanthocyanidins and flavonols) during their development. A previous study has shown that a laccase (AtLAC15) encoded by the TRANSPARENT TESTA 10 (TT10) gene could trigger flavonoid oxidation in the seed coat. If both proanthocyanidins (PAs) and flavonols appear to be TT10 protein substrates, only PA oxidation leads to brown pigments responsible for the mature seed coat color. An important consequence of TT10 activity on seed flavonoid metabolism is an increased ratio of insoluble to soluble PAs. The physiological functions of TT10 are still unknown, however defense against biotic and abiotic stresses, either constitutive or induced, may be predicted on the basis of present knowledge on polyphenoloxidases. The purpose of this thesis was to perform a functional characterization of the TT10 gene. A part of the work was devoted to the analysis of the regulatory mechanisms controlling the developmental pattern of TT10 gene expression in seeds and vegetative plant parts. The functional 5’-dissection of a 2.0-kb promoter realized with the uidA reporter gene encoding b-glucuronidase (GUS) was performed to identify regions responsible for activation in seed and other plant organs. TT10 promoter happens to be activated exclusively in seed coat and siliques. Directed mutagenesis was undertaken to precise the regulatory role of in silico-detected cis-acting regulatory elements (CAREs) located in a 194-bp region necessary for expression in seed coat. TT10 gene expression assessed in different tissues at various stages of development using qRT-PCR matched promoter activity pattern. Natural variation for TT10 expression among Arabidopsis accessions was also detected, with the levels of TT10 mRNA in Cvi, Ler and Sha being strongly reduced compared to the ones in Ws, Col and Bay. The impact of this molecular polymorphism on seed flavonoid composition, as analyzed on mature seeds with LC-MS, is discussed. In silico analysis of the TT10 promoter revealed the presence of putative CAREs potentially involved in signaling and response to biotic and abiotic stresses. However histochemical analysis of GUS activity in transgenic Arabidopsis plantlets expressing pTT102:0 kb : GUS failed to detect any ectopic activity when submitted to a variety of stresses. This result suggests that transcriptional response to environmental stimuli is highly constrained by developmental parameters. TT10 appeared to be the only member of the laccase gene family to be strongly expressed in seeds. TT10 function may have evolved towards flavonoid oxidation by co-localization with these substrates, which is ensured by tissue-specific gene expression.; Les graines d’Arabidopsis accumulent des flavonoïdes (proanthocyanidines et flavonols) durant leur développement. Une étude précédente a montré qu’une laccase (AtLAC15) codée par le gène TRANSPARENT TESTA 10 (TT10) induisait l’oxydation des flavonoïdes au niveau des téguments. Si les proanthocyanidines (PAs) et les flavonols sont des substrats de la protéine TT10, seule l’oxydation des PAs conduit à la formation de pigments bruns responsables de la couleur de la graine mature. Une importante conséquence de l’activité de TT10 sur les flavonoïdes de la graine est l’augmentation du rapport PAs insolubles / PAs solubles. Les fonctions physiologiques de TT10 sont toujours inconnues, mais un rôle dans la défense contre des stress biotiques et abiotiques constitutifs ou induits peut être prédit sur la base des connaissances actuelles sur les polyphénoloxydases. L’objectif de cette thèse était de réaliser une analyse fonctionnelle du gène TT10. Une partie de l’étude était consacrée à l’analyse des mécanismes de régulation contrôlant le pattern développemental d’expression du gène TT10 dans les graines et les parties végétatives. Une dissection fonctionnelle en 5’ d’un promoteur de 2.0-kb réalisée à l’aide du gène rapporteur uidA codant la b-glucuronidase (GUS) a été réalisée pour identifier les régions responsables de l’activation du promoteur dans les graines et les autres parties de la plante. Le promoteur de TT10 est activé exclusivement dans les téguments de la graine et les siliques. Une mutagénèse dirigée a été réalisée dans une région de 194 pb nécessaire à l’expression dans les téguments, pour préciser la fonctionnalité des éléments régulateurs agissant en cis (ERACs) identifiés in silico. L’expression du gène TT10 mesurée par qRT-PCR dans différents tissus et à différents stades de développement est en accord avec le pattern d’activité du promoteur. Une variation naturelle pour l’expression de TT10 a aussi été détectée parmi plusieurs accessions d’Arabidopsis, avec des niveaux d’ARNm mesurés chez Cvi, Ler et Sha fortement réduits par rapport à ceux relevés chez Ws, Col et Bay. L’impact de ce polymorphisme moléculaire sur la composition en flavonoïdes de la graine, analysée sur graines matures par LC-MS, est discuté. L’analyse in silico du promoteur de TT10 a révélé la présence d’ERACs potentiellement impliqués dans la signalisation et la réponse aux stress biotiques et abiotiques. Cependant l’analyse histochimique de l’activité GUS de plantes transgéniques exprimant pTT102:0 kb : GUS n’a pas permis de détecter d’activité ectopique en présence de stress variés. Ce résultat suggère que la réponse transcriptionnelle aux stimuli environnementaux est fortement conditionnée par les paramètres développementaux. TT10 est le seul membre de la famille des laccases à être exprimé fortement dans les graines. La fonction de TT10 a probablement évolué vers l’oxydation des flavonoïdes par la co-localisation avec ces substrats, qui est assurée par la spécificité tissulaire d’expression du gène.