Inativação fotodinâmica de endósporos bacterianos: aplicação de alta pressão como coadjuvante na ligação de fotossensibilizador

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Industrial e Ambiental Os endósporos bacterianos representam riscos significativos em muitas atividades humanas, pelo que é fundamental descobrir formas de inativar estas estruturas. A terapia fotodinâmica (PDT) têm-se revelado uma alternativa promissora para inativar microrganismos patogénicos. Com este trabalho pretendeu-se avaliar o efeito da alta pressão como coadjuvante do efeito fotodinâmico, na inativação de endósporos de Bacillus cereus, usados como modelo biológico de endósporos bacterianos. Endósporos de B. cereus foram preparados em meios de esporulação e conservados a -20 °C até à realização dos ensaios. Como fotossensibilizador (PS), utilizou-se uma porfirina tetracatiónica (Tetra-Py+-Me), aplicada nas concentrações de 5 e 20 􀈝M. Os endósporos foram incubados durante 30 min a 37 °C no escuro, na presença de PS, para permitir a adsorção do PS ao material do endósporo. A potência da luz branca usada na irradiação foi 1690 W.m-2. O efeito dos vários tratamentos foi avaliado por comparação dos resultados com os valores iniciais da concentração de endósporos viáveis na suspensão não tratada. As variáveis em estudo foram a concentração de PS, a pressão aplicada, a temperatura de incubação e o tempo de exposição à luz branca. Em cada experiência foram incluídos os seguintes controlos: controlo claro (exposto à luz sem PS), controlo escuro (com PS mas não irradiado), controlo de pressão (pressurizado sem PS e não irradiado) e controlo escuro pressurizado (exposição ao PS a 300 MPa, sem exposição à luz). A concentração de endósporos viáveis antes e depois de cada tratamento foi determinada por contagem de colónias após sementeira em meio sólido. O tempo de congelação do stock de endósporos afetou a adsorção de PS. Alíquotas com períodos de armazenamento a - 20 °C, entre 15 e 43 dias, produziram valores de adsorção de PS entre 3,63×105 e 8,01×105 moléculas de PS.UFC-1, quando expostas a 5 μM de PS. O aumento da temperatura de préincubação no escuro de 37 para 50 °C, resultou no aumento da quantidade de PS adsorvido de 13,1×105 para 26,3×105 moléculas de PS.UFC-1, na presença de 5 μM de PS. A aplicação de pressão (300 MPa, durante 30 minutos) resultou num aumento de 30 a 90% na quantidade de PS ligado aos endósporos nas experiências realizadas com 5 μM de PS. Com 20 μM de PS, os valores de adsorção com pressurização foram 2,3 a 76,1 vezes superiores aos obtidos com pré-exposição ao PS à pressão atmosférica. Os fatores de inativação máximos foram registados para o tratamento correspondente à aplicação de pressão durante o período adsorção do PS, e variou entre 1,1 e 2,4 log. Embora os fatores de inativação obtidos sejam ainda modestos, os resultados demonstram que a aplicação de alta pressão melhora a ligação do PS aos endósporos e pode funcionar como um fator coadjuvante da inativação fotodinâmica de endósporos bacterianos. Bacterial endospores represent significant risks in many human activities, therefore it is essential to find ways to inactivate these structures. Photodynamic therapy (PDT) have proven to be a promising alternative to inactivate pathogenic microorganisms. The aim of this work was to evaluate the effect of high pressure as an adjunct to photodynamic effect in the inactivation of Bacillus cereus endospores, used as biological models of bacterial endospores. Endospores of B. cereus were prepared in sporulation culture media, and stock suspensions were preserved at – 20 ºC. A tetracationic porphyrin (Tetra-Py+-Me) applied at concentrations 5 and 20 μM was used as photosensitizer (PS). Endospores were incubated in the dark for 30 min at 37 °C, in the presence of PS to allow the adsorption of the PS to the endospore material. For the assessment of the photodynamic inactivation, samples were irradiated with white light of 1690 W.m-2 of intensity. The effect of the different treatments was assessed by comparing the results with the initial concentration of viable endospores in the untreated endospore suspension. The variables assessed in this study were PS concentration, applied pressure, incubation temperature and white light exposure time. Each experiment included the following controls: light controls (exposed to light without PS), dark controls (with PS but not irradiated), pressurized controls (pressure without exposure to light or PS) and pressurized dark controls (PS exposure at 300 MPa, without irradiation). The concentration of viable endospores before and after each treatment was determined by colony counting after pour-plating in solid medium. The storing time of the endospore stock affected the uptake of PS. Aliquots with periods of storage at -20 °C between 15 and 43 days produced PS adsorption values between 3.63×105 and 8.01×105 PS molecules.UFC-1, when exposed to 5 μM of PS. An increase in the pre-incubation temperature, from 37 to 50 °C, improved the adsorption of PS, which increased from 13.1×105 to 26.3×105 PS molecules.UFC-1, in the presence of 5 μM of PS. Pressurized samples (300 MPa for 30 minutes in the presence of PS) showed values of PS adsorption 30 to 90% higher than the controls, in which the dark exposure to 5 μM of PS was conducted at atmospheric pressure. With 20 μM of PS, pressured treatments revealed 2.3 to 76.1-fold increases in PS binding. The maximum inactivation factors were observed in the treatment corresponding to photodynamic inactivation after high pressure processing during PS adsorption and ranged between 1.1 and 2.4 log. Although the obtained inactivation factors are still modest, the results show that the application of high pressure improves the binding of PS to endospores and can function as a co-factor in photodynamic inactivation of bacterial endospores.