Multiplex Real-Time PCR in Bovine Mastitis Diagnostics

Mastitis is the most common and economically damaging production disease of dairy cows. In the majority of cases it is induced by intramammary infection with a pathogen. Identification of mastitis-causing pathogens enables treatments to be targeted appropriately, avoiding unnecessary antimicrobial treatments, and enabling design of the best possible herd level management protocols. Diagnosis of bovine IMI has been traditionally based on microbial culture of aseptically taken quarter milk samples. Due to the requirements of modern dairy production and development of molecular technologies, milk samples can be examined for target pathogens with DNA-based methods such as multiplex real-time PCR assays. Despite several years of routine use of PCR assays in some countries, scientific knowledge concerning interpretation of the results is sparse. This dissertation focuses on providing new information for diagnosing bovine mastitis using multiplex real-time PCR. In order to accomplish that, first a commercial multiplex real-time PCR assay was compared with the current reference method, conventional culture (I). It showed that PCR was a reliable diagnostic method for Staphylococcus aureus, but less reliable for diagnosing true non-aureus staphylococci infections. In an experimental challenge study (IV), elimination of Staphylococcus epidermidis and S. simulans was followed with PCR in addition to conventional culture. The results showed that PCR yielded target-positive results for several days after the culture results were negative. Subsequently, the time of sampling related to the onset of inflammation may be of importance when interpreting the PCR results. Secondly, quarters with suspected mastitis were sampled using two experimental techniques, in addition to the conventional aseptic technique (II, III), and examined with multiplex real-time PCR. In the needle technique, the whole teat and teat area were bypassed. With the cannula technique, the teat orifice and the teat canal were bypassed. The results showed that samples taken with alternative techniques were of better hygienic quality. We also reported that over half of the non-aureus staphylococci findings in our PCR results originated from sites other than the mammary gland. A diagnosis of a true IMI or mastitis, with possible outcome of an antimicrobial treatment course for the animal, cannot be based solely on a PCR result, but must be combined with all the available information about a cow`s history, symptoms, changes in milk and indicators of inflammation. Some microbes detected with PCR can be considered to be contaminants, especially when present with low levels of DNA. If the signs of the cow or the degree of udder inflammation do not fit the usual signs caused by the pathogen detected, the possibility of contamination should be considered. Lypsylehmien yleisin ja kallein tuotannollinen sairaus on utaretulehdus. Lypsylehmän elinympäristö on täynnä erilaisia mikrobeja ja yleisin syy utaretulehdukselle on yhden mikrobilajin aiheuttama infektio utareneljänneksessä. Tulehdusta aiheuttavat mikrobit tulee tunnistaa luotettavasti ja nopeasti, jota voidaan arvioida hoitotarve, kohdistaa hoito oikein ja välttää turhia antibioottikuureja. Utaretulehdusten aiheuttajista muodostuu ajan kuluessa tilakohtaista tietokantaa, jota käytetään apuna utareterveyden hallinta- ja utaretulehduksen ennaltaehkäisysuunnitelmissa. Utaretulehdusten diagnosoinnin viitemenetelmä on bakteeriviljely. Viljelyssä tulehdusten aiheuttajat tunnistetaan ottamalla aseptinen neljänneskohtainen maitonäyte ja viljelemällä maitoa erilaisille kasvatusalustoille. Bakteerien lajitunnistus perustuu niiden ulkonäköön, kasvuun tietyillä alustoilla ja kemiallisiin reaktioihin. Viljelyssä nähdään aina vain elinkelpoisia bakteereita. Tällöin voidaan olettaa, että ne pystyvät myös aiheuttamaan taudin. Lisäksi bakteerikantoja on voitu tallettaa tutkimuskäyttöön. Näytteiden käsittely, kuljetus ja tulehdusmaito itsessään tuovat omat haasteensa viljelyn onnistumiseen. Selvästi sairaastakin utareneljänneksestä peräisin olevan maitonäytteen viljelytulos voi usein olla negatiivinen. Lisäksi lajitunnistus kestää kuljetukseen kuluvan ajan lisäksi vähintään kaksi vuorokautta, joka on pitkä aika odottaa tulosta ja sen mukaisia toimenpiteitä nykyaikaisilla, tehokkuuteen pyrkivillä tiloilla. Modernit, molekyylibiologiaan perustuvat menetelmät tulivat bakteeriviljelyn rinnalle 2000-luvun alussa. Yleisin Suomessa käytetty menetelmä on PCR (polymerase chain reaction), jossa reaaliaikaisesti voidaan tunnistaa jopa viisitoista eri utaretulehduksen taudinaiheuttajaa. PCR perustuu tietyn, kullekin bakteerille ominaisen geenin monistamiseen suoraan maidosta, ilman viljelyä. Jos maitonäyte sisältää kohdebakteerin DNA:ta, sen monistumisen aiheuttama fluoresenssi voidaan havaita tietyllä aallonpituudella. Mitä nopeammin monistuminen havaitaan, sitä enemmän kyseistä bakteeri-DNA:ta näytteessä on. Maitonäytteeseen voidaan lisätä säilöntäainetta, mikä helpottaa kuljetusta. PCR on nopea ja objektiivinen testi. Lajitunnistus on erittäin tarkkaa, mutta bakteerin elinvoimaisuudesta ei voida tehdä päätelmiä. Suomessa PCR-testi (PathoProofTM Mastitis PCR Assay) on ollut utaretulehdusdiagnostiikan rutiinimenetelmä jo vuodesta 2010, mutta tieteelliseen tietoon perustuvia ohjeita tulosten tulkinnasta ei ole ollut saatavilla. Tämän väitöskirjan tarkoituksena oli tuoda uutta tietoa helpottamaan PCR-tulosten tulkintaa naudan utaretulehdusdiagnostiikassa. Tämä tehtiin vertailemalla PCR:ää ja perinteistä viljelyä, sekä tutkimalla, kuinka erilaiset näytteenottotekniikat vaikuttavat PCR-tuloksiin. Ensimmäisessä, PCR- ja viljelytuloksia vertailevassa tutkimuksessa todettiin, että verrattuna perinteiseen viljelyyn, PCR on luotettava menetelmä Staphylococcus aureuksen tunnistamiseen puhtaasti otetusta maitonäytteestä. Tulosten perusteella suosittelimme, että pienetkin määrät S. aureus DNA:ta tulisi huomioida näytetuloksissa. Sen sijaan muiden stafylokokkien (non-aureus staphylocci, NAS, tai koagulaasi-negatiiviset stafylokokit) osalta vähäinen määrä tunnistettua DNA:ta ei välttämättä ole kliinisesti merkittävä löydös. PCR-paneelin todettiin olevan riittävän kattava rutiinikäyttöön. Viljelyä ja PCR tuloksia verrattiin myös väitöskirjan neljännessä osassa, jossa kahden eri stafylokokkilajin poistumista utareneljänneksestä seurattiin kahden viikon jaksoissa. PCR-tulokset olivat positiivisia vielä useita päiviä sen jälkeen, kun neljännes oli todettu perinteisen viljelyn avulla parantuneeksi. PCR-tuloksen luotettavuus oli paras, jos näyte otettiin heti tulehduksen akuutissa vaiheessa. Tulehduksen loppuvaiheessa positiivinen PCR-tulos voi olla peräisin jo kuolleesta, poistuvasta bakteerimassasta. Tutkielman toisessa ja kolmannessa osassa vertailtiin näytteenottotekniikan vaikutusta PCR-tuloksiin. Perinteisen, aseptisen maitonäytteenottotekniikan lisäksi käytimme kokeellisia neula- ja kanyylimenetelmiä. Kanyylinäytteenotossa vedinkanava ohitettiin kokonaan steriilin kanyylin avulla. Neulanäyte otettiin ohuella neulalla suoraan maitokammiosta, jolloin koko vedin ja sen alue ohitettiin. Kokeellisesti otetut näytteet sisälsivät vähemmän lajeja per näyte ja olivat siten hygieeniseltä laadultaan parempia kuin perinteisesti otetut näytteet. Vetimen alueelta näytteeseen joutuneet bakteerit esiintyivät tuloksissa pääosin vähäisillä DNA-määrillä. Jos vakavina taudinaiheuttajina pidettyjä bakteereita (kuten Streptococcus uberis, Str. dysgalactiae ja S. aureus) havaittiin sekä vaihtoehtoisella että perinteisellä menetelmällä otetuissa tuloksissa, niiden DNA-määrä oli suuri. Utaretulehdusdiagnoosi koostuu lehmän esitiedoista, tulehduksen voimakkuutta kuvaavasta soluluvusta, näkyvistä oireista sekä maitomuutoksista. Bakteerin laji ja määrä ovat diagnoosia täydentäviä tietoja, joiden todenmukaisuutta tulee peilata edellä mainittuihin seikkoihin. Näiden tietojen perusteella voidaan päättää lehmän mahdollisesta antibioottihoidosta tai muista toimenpiteistä. Etenkin PCR-pohjaisessa diagnostiikassa vaarana on, että epähygieenisesti otettu maitonäyte antaa kliinisesti merkityksettömän tai jopa virheellisen diagnoosin. Jos lehmän oireet ja saatu tulos eivät eläinlääkärin mielestä ole yhteneväisiä, näytteen likaantumisen riski sekä mahdollisuus jonkin PCR-paneelin ulkopuolisen mikrobin aiheuttamaan tulehdukseen tulee pitää mielessä. Suosittelemme, että uusintanäyte lähetetään tällöin perinteiseen viljelyyn.