Isolation of two novel Chlorella vulgaris and Tetraselmis chui mutants with improved protein contents and pigments for food applications

Microalgae are a worldwide food source, largely consumed by humans as food or, indirectly, as feed. Their biomass might contain high levels of protein, lipids, fatty acids, amino acids, and vitamins. They are unicellular organisms capable of living in the most diverse environments, being able to grow faster than other photoautotrophs and in non-conventional growth media that do not require either potable water or arable land. With such characteristics, microalgae can become an important alternative food source in the near future since the world population is estimated to reach 10 billion people before 2050. Microalgae are produced and consumed as high-quality nutritional food, but there is an urgent need to improve existing microalgae-based products since their organoleptic properties, such as their “grassy” taste, are not consensually accepted by the consumer. The present work aims to create new strains from microalgal species already registered as novel food, namely Chlorella vulgaris and Tetraselmis chui, to improve the quality of the produced biomass and the overall consumer acceptance. For this purpose, random chemical mutagenesis using the alkylating agent ethyl methane sulphonate (EMS) was carried out to generate mutants with higher protein contents and/or lower amounts of chlorophyll. Afterwards, the best performing strains were selected using visual scoring regarding pigmentation and flow cytometry techniques. Upon implementing this selection pipeline, two C. vulgaris strains were isolated, namely the C3 strain, a non-mutagenized isolate able to grow significantly faster on solid medium compared to the wildtype (WT) culture; and a second mutant, GL3, obtained from the C3 strain. Although the C3 strain presented higher protein contents, the GL3 displayed vestigial chlorophyll contents, lower carotenoid levels, and higher protein content than the original WT strain. The GL3 strain grown under heterotrophic conditions reached higher cell concentrations as compared to the WT, strongly suggesting that the mutant strain GL3 might become a relevant source of protein, being suitable to be produced on a larger scale to generate food products with enhanced organoleptic properties. As microalgas são organismos aquáticos unicelulares, por vezes coloniais, que normalmente são eucariotas, à exceção das cianobactérias, que são procariotas. Uma parte significativa destes organismos são fototróficos obrigatórios. embora possam ser mixotróficos, ao consumirem fontes de carbono orgânico como a glucose e a frutose, para além de fixarem carbono na forma de CO2. Podem ser ainda organismos heterotróficos facultativos, em que na falta de energia luminosa ou de carbono inorgânico, se especializaram no consumo de material orgânico. Esta forma de trofia pode ser encontrada em regiões de águas oligotróficas ou extremas, como ecossistemas cavernosos, debaixo de glaciares ou lagos subglaciais. Em termos ecológicos, a principal função desses organismos no ambiente natural é a alta carga de produção primária que são responsáveis quando fazem fotossíntese, sendo os responsáveis pela maior parte do O2 disponível no planeta, seja em ambientes aquáticos ou atmosfera. As microalgas podem variar de tamanho, sendo consideradas como tal microrganismos cuja célula está na faixa entre os 200 a 20 μm. As história evolutiva das microalgas mostra que estes organismos foram capazes de colonizar praticamente qualquer ambiente com algum tipo de habitat aquático por menor que seja. Estes ambientes vão desde grandes lagos e mares até regiões escuras e enclausuradas, incluindo ambientes com corpos d’água periódicos, mesmo que assolados por longas épocas de seca como o deserto do Atacama. A variabilidade genética e adaptabilidade das microalgas é uma questão chave para entender as caracteristicas biológicas, morfológicas e bioquímicas destes seres, que apresentam uma grande varíedade de lípidos, ácidos gordos, aminoácidos e proteínas. Essa rica composição torna os organismos deste grupo alvo de estudos para o desenvolvimento e pesquisa de produtos como ração para animais, alimento humano, produção de biodiesel, fármacos e cosméticos. Atualmente, as microalgas já são utilizadas na aquacultura como alimento vivo para criação de peixe, como biomassa para suplementação alimentar humana, fertilizantes e até mesmo como tratamento terciário de estações de tratamento de água residual de origem urbana ou industrial. A União Europeia já aceita cerca de 20 espécies diferentes de microalgas como suplemento alimentar ou alimento. Entre elas estão: Chlorella vulgaris, Arthrospira platensis (comummente designada por “Spirulina”), Dunaliella salina e Tetraselmis chui. Uma grande variedade de espécies já são atualmente produzidas comercialmente por todo o mundo, especialmente para ração animal. Porém, a cada ano que passa, o mercado para a alimentação e suplementação humana vem crescendo exponencialmente. Isso se deve ao interesse do consumirdor em uma alimentação mais saudável e natural, que diminui a procura de alimento de origem animal e aumenta a apetência por sucedâneos de origem vegetal. Aindaassim, estima-se que a produção alimentar mundial até o ano de 2050 será insuficiente, aumentando a necessidade do desenvolvimento de produtos que ocupem uma menor área para produção, sendo de alta qualidade e rendimento. A produção de microalgas se encaixa com as necessidades previstas, sendo que além de poder ser produziada em áreas inférteis e não aráveis, não necessita o uso de água potável. Tal é possível, pois há uma variada gama de espécies marinhas que podem ser domesticadas e produzidas em raceways, greenwalls e outros fotobiorreatores em que o meio de cultura pode ser feito com água do mar. A produção industrial de microalgas depende de diversas etapas, que vai desde o isolamento e identificação da espécie até produção de biomassa em larga escala. E mesmo com a tecnologia atual a produção ainda se depara com algumas limitações que tornam o processo não tão barato quanto o esperado, seja pela presença de contaminações, como pela baixa produção de algumas espécies de microalgas. Para desenvolver melhores produtos, a prospecção por diferentes espécies ou estirpes de microalgas é uma atividade constante de empresas e laboratórios especializados nos estudos e produções de microalgas. Um dos métodos para aumentar a produção é o desenvolvimento de novas estirpes, seja por domesticação e aprimoração das condições fisicoquímicas de produção ou pela mutagénese aleatória em busca de novas caracteristicas favoráveis. Algumas das propriedades mais procuradas é o aumneto da produção de proteina no conteúdo total da biomassa assim como o melhoramento das qualidades organolépticas da biomassa para aumentar ainda mais a aceitação do consumidor de produtos baseados em microalgas. Uma das causas principais para o cheiro e sabor da biomassa de microalgas ser tão acentuado é a clorofila, que, através da mutagenese, pode ser reduzida, melhorando as suas características organolépticas. Além disso, estas microalgas melhoradas tendem em apresentar uma maior percentagem de proteina total na sua biomassa, que é algo muito apreciado pela indústria alimentar. Um dos métodos para promover a mutagenese aleatória de microalgas é a aplicação de um agente alquilante como o etilmetanosulfonato (EMS) que causa uma alteração em resíduos de guanina, alterando a composição genética do material genético (e.g., pares de bases GC são mutados para AT) de forma pontual e aleatória. O facto do EMS gerar mutações pontuais torna a mutagénese mais aceitável ao consumidor do que a introdução de genes heterólogos. Além disso, perante a União Européia, tal processo não é considerado como gerador de organismos genéticamente modificados, o que facilita a sua produção à escala industrial. Essa metodologia já foi testada em diversas espécies de microalgas, como Dunaliella tertiolecta, Nanochloropsis sp. e diversas espécies de Chlorella spp. Em todos os casos, foi possível desenvolver estirpes de alta qualidade, tanto na questão de pigmentos, como lípidos, ácidos gordos e proteínas. Um dos pontos cruciais para garantir que a estirpe melhorada geneticamente continua a ser a mesma, após o processo, não sendo devido ao isolamento de algum contaminante originalmente presente na estirpe que sofreu o processo de mutagenese, é impotante realizar a identificação molecular, antes e depois de realizar a metodologia de mutagénese. A indentificação molecular se dá pela extração de material genético, seguido pela amplificação através de reação em cadeia da polimerase (PCR) de uma parte do gene 18S, que normalmente consiste em 1000 ou mais pares de base. Ainda assim, para algumas espécies de microalga a região 18S não é suficiente para se identificar diferenças interespecíficas, o que torna necessária a utilização de outros alvos como região 28S ou os espaçadores ITS1 e ITS2. Após a amplificação e sequenciação da região escolhida, é feita uma análise de similaridade com base de dados especializadas para identificar a espécie mais provável através do grau de semelhança de sequências. Para este trabalho foram utilizadas duas estirpes de espécies diferentes, Chlorella vulgaris e Tetraselmis chui, tendo estas sido cedidas pela empresa Allmicroalgae, dentro do projeto conjunto ProFuture, para a produção de estirpes melhoradas por mutagénese química aleatória através do agente EMS. Chlorella vulgaris é uma espécia já amplamente estudada desde os anos 50, e foi pioneira para a produção de biomassa para o consumo humano, já sendo perspetivada como alimento para astronautas no começo da corrida espacial. Foi prontamente aceite como "novel food" pela União Europeia, por ter um longo histórico de consumo humano durante muitos anos. A mutagénese de microalgas começou por estudos realizados em Chlorella vulgaris, para o melhor entendimento e estudo do mecanismo fotossintético, sendo provada a possibilidade de produzir estirpes de diferentes cores desde então. Tetrasselmis chui é uma das espécies de microalgas mais recentes nos termos de "novel food", e tem sido uma espécie de grande interesse por apresentar uma alta produção de biomassa e ter uma boa qualidade bioquímica, por ter uma diversidade de carotenoides, lípidos e aminoácidos de interesse nutricional. O atual projeto tem como objetivo desenvolver mutantes de Chorella vulgaris e Tetraselmis chui como uma menor taxa de clorofila e maior taxa de proteína. No caso da T. chui, no período estipulado para o projeto, não foi possível desenvolver um mutante cuja a pigmentação fosse visivelmente diferente, o que já foi explicado em outros projetos pela probabilidade de a espécie ser um organismo fotoautotrófico obrigatório, dificultando a produção de mutantes, devido ao facto de mutações no aparelho fotossintético que impliquem alterações drásticas de pigmentos serem, em geral, letais. Já no caso da Chlorella vulgaris, foi possível obter diferentes estirpes a partir da estirpe selvagem, nomeadamente a estirpe C3, que mostrou um melhor desenvolvimento em questão ao crescimento de unidades formadoras de colónias em heterotrofia e mixotrofia, mas sem revelar alterações visíveis em termos de pigmentos fotossintéticos. Assim sendo, foi selecionada a estirpe C3 para uma nova ronda de mutagénese aleatória, na qual foi possivel isolar e caracterizar a estirpe GL3 que apresentava visivelmente uma coloração amarelada. De facto, ao analisar a biomassa, foi detectado uma quantidade 20 vezes menor de clorofila e uma maior produção de proteína em gramas por 100 gramas de biomassa. A produção de uma estirpe como a GL3 foi considerada como um sucesso na aplicação da metodologia utilizada, sendo aquela enviada para o nosso parceiro empresarial para ser produzida em larga escala após uma prospecção mais detalhada da qualidade e aceitação do mercado desta biomassa inovadora.