Impact of algae processing on fish gut homeostasis

O aumento da produção aquícola intensiva é importante para garantir a necessidade de peixe para consumo humano. É assim reconhecida por este motivo como um recurso essencial para o desenvolvimento de um uso mais conservado e sustentável dos oceanos. O desenvolvimento da aquacultura de uma produção extensiva para uma produção mais intensiva, destacou a importância do bem-estar animal face ao stress a que o peixe está sujeito, como um fator importante na obtenção de uma produção mais sustentável e para garantir um melhor produto para o consumidor. De forma a garantir o bem-estar animal dos peixes de aquacultura, têm vindo a ser desenvolvidos métodos com uma abordagem mais natural e amiga do ambiente. Uma opção, são os alimentos funcionais, ou seja, alimentos que melhoram uma ou mais atividades alvo no organismo, além dos efeitos da nutrição fundamental. A introdução de microalgas como ingrediente funcional na alimentação de peixes tem criado altas expectativas devido à sua riqueza em compostos biologicamente ativos, com muitos benefícios com potencial funcional, tais como a estimulação imunológica e antioxidante. A utilização de microalgas não é já aplicada na produção aquícola em alta escala, pois a estrutura da membrana celular pode ser um dos principais fatores que reduz o acesso aos compostos intracelulares das microalgas. A rutura celular apresenta-se desta forma, como um processo opcional para aumentar a biodisponibilidade dos compostos dentro das células das microalgas. A homogeneização de alta pressão é o método eficaz de rutura física da estrutura da parede celular, sem adicionar novas substâncias à suspensão de microalga, para qualquer espécie de microalga. Neste estudo o intestino é o órgão com relevância, pois é um dos órgãos digestivos adaptados à estratégia de alimentação dos peixes. Caracteriza-se por ser sensível a perturbações ambientais e homeostáticas, que relacionam a saúde do peixe com a manutenção intestinal através de respostas, como a antioxidante e imunitária. A capacidade de resposta do sistema imunológico do peixe pode ser diretamente afetada pelo stress a que este fica suscetível devido à imunossupressão pelo mesmo, portanto, quanto mais exposto o peixe ao stress, maior a suscetibilidade a possíveis doenças. De forma a mitigar o efeito do stress, muitos estudos mostraram uma melhoria na trilha do intestino de peixes quando alimentados com algas, nomeadamente a nível das respostas antioxidante e imune. No intestino a resposta antioxidante ocorre na presença de espécies reativas de oxigênio (ROS). Estas por sua vez podem ser radicais livres ou não radicais derivados do oxigênio, que podem ativar uma resposta antioxidante por componentes enzimáticos e não enzimáticos. Da mesma forma, a resposta imune no intestino é essencial para a manutenção imunológica e para o equilíbrio dinâmico dos peixes. Se o trato gastrointestinal for danificado ocorre uma resposta inflamatória. Com este propósito, o objetivo deste estudo foi comparar as respostas antioxidantes e imunológicas no intestino da Dourada (Sparus aurata), quando exposto a biomassa de algas processadas e não processadas. O percurso metodológico desenvolveu-se por várias etapas: 1 - As pastas sólidas congeladas de biomassa de microalga industrial foram fornecidas pela Allmicroalgae - Natural Products, S.A. e levadas para o Laboratório Nacional de Energia e Geologia em Lisboa, Portugal, para serem processadas. Nannocholopsis oceanica e Phaeodactylum tricornutum foram processadas por homogeneização a alta pressão seguindo um modelo de superfície resposta, com os parâmetros pressão, número de passagens e concentração da suspensão num PandaPLUS 2000 homogeneizador. 2 - Cada amostra de microalga processada foi analisada quanto à integridade da membrana celular por um CytoFLEX Flow Cytometer equipado com um laser de argônio de 488 nm. 3 - Após a obtenção da ótima suspensão processada de cada alga, através de um modelo da mucosa intestinal in vitro, 18 peixes foram dissecados e os tecidos do intestino colocados numa placa de cultura de células com as algas em três diferentes concentrações (8 mg/mL, 40 mg/mL e 200 mg/mL). 4 - Dos 18 peixes apenas 9 foram para analisar os marcadores moleculares da resposta imune (ciclooxigenase 2 – Cox2 e imunoglobulina M – IgM) e os marcadores da resposta antioxidante (catalase – CAT, glutationa peroxidase – GPx e fator 2 relacionado ao fator nuclear eritróide 2 – Nrf2). Este estudo demonstrou que a microalga processada por um homogeneizador de alta pressão funciona como um alimento funcional, mantendo a capacidade imunológica para os genes selecionados no intestino da Dourada. Os resultados obtidos na análise da resposta imune demonstraram, ainda, que a disrupção aumenta o potencial da microalga como imunoestimulante para os genes selecionados para a mucosa intestinal da dourada, com maior relevância a Nannochloropsis oceanica processada, na concentração de 8 mg/mL e 40 mg/mL, em relação à N. oceanica não processada. Em contrapartida, no caso da Phaeodactylum tricornutum o intestino da dourada apresentou uma tendência para aumentar a estimulação da resposta imune, na concentração de 40 mg/mL, mas uma diminuição na concentração de 200 mg/mL, apresentando a concentração como um possível fator limitante. Este estudo não indicou diferenças significativas na resposta antioxidante do intestino da dourada entre alga não processada e alga processada, mas outros estudos mostram que diferenças podem ser esperadas. Desta forma os resultados do estudo sugerem uma resposta mais regulada na mucosa intestinal da dourada sempre que estimulada por algas processadas. Pesquisas futuras são necessárias para confirmar a capacidade de melhorar a estimulação imunológica e antioxidante das algas por um homogeneizador de alta pressão. Pode ser pelo acréscimo dos dados dos 9 peixes por analisar, utilização de diferentes marcadores ou alteração dos parâmetros de estudo. Aquaculture fish welfare management has been developing by approaching a more naturally friendly method. The introduction of algae as a functional ingredient created the highest expectations for algae richness in biologically active compounds, with many benefits like immune and antioxidant stimulation. Unfortunately, these compounds may have a limited restriction from the cell wall membrane. Removing the cell wall limiting factor could increase algae bioavailability of compounds as well as the functional potential. For this purpose, this study compared the antioxidant and immune responses in the intestine of gilthead seabream (Sparus aurata), when exposed to processed lysed algae biomass and unprocessed ones. The comparison followed two factors, the treatment (disrupted or whole algae) and concentration. Nannocholopsis oceanica and Phaeodactylum tricornutum were disrupted through high-pressure homogenization and applied in different concentrations in the fish intestine tissue. The study demonstrated a potential immune capacity for the genes selected in the seabream intestine. Nannochloropsis oceanica disrupted at a concentration of 8 mg/mL and 40 mg/mL had better results than N. oceanica not disrupted. Further research is needed to complement and understand these results. This work is part of the project PERFORMALGAE, ALG-01-0247-FEDER-069961, supported by Portugal and the European Union through FEDER, COMPETE2020 and CRESC Algarve 2020, in the framework of Portugal2020.