Viability of Weissella cibaria during the integrated fermentation and encapsulation processes using agro-industrial residues in the formulation of the substrate and double emulsion followed by complex coacervation in the encapsulation

Para la producción de biomasa bacteriana y sus metabolitos mediante procesos de fermentación láctica, comúnmente se han utilizado sustratos comerciales; sin embargo, se ha promovido el uso de residuos agroindustriales como sustratos de fermentación de bacterias ácido lácticas (BAL) y, como posible alternativa para reducir los costos de producción de probióticos. Por otra parte, mejorar la viabilidad de las BAL ha sido un desafío persistente en las aplicaciones de microorganismos con potencial probiótico en alimentos. Por lo cual, diferentes tecnologías de encapsulación han sido evaluadas para proteger las células bacterianas y facilitar su aplicación. En este contexto, el objetivo general de esta investigación fue integrar los procesos de fermentación y encapsulación de la bacteria ácido láctica Weissella cibaria utilizando residuos de piña (epicarpios y núcleos) y subproducto de sacha inchi como sustrato de fermentación, y combinando las tecnologías doble emulsión y coacervación compleja para su encapsulación. Objetivo que se desarrolló en cuatro fases. En la 1era fase se caracterizó elemental, proximal, física y químicamente los residuos de piña y el subproducto de sacha inchi (SSI) para la formulación de un sustrato de fermentación (SFS). El SFS se hidrolizó y se utilizó para la producción de una bacteria ácido láctica (Weissella cibaria). Los resultados mostraron que los residuos de piña y SSI fueron fuentes potenciales de macro y micronutrientes (carbohidratos, proteínas y minerales). Tras la aplicación del SFS en el proceso de fermentación con W. cibaria se obtuvieron resultados similares a cuando se utilizó el sustrato comercial (MRS); producción de biomasa (2.9±0.1 y 3.5±0.1 g L-1) y viabilidad (9.8±3.2 y 9.9±2.7 Log10 CFU mL-1). En la 2ª fase, se optimizó la producción de biomasa de W. cibaria mediante metodología de superficie de respuesta considerando las variables independientes: temperatura (32 – 40 °C), pH (5.0 – 6.0), y agitación (100 - 150 rpm). La optimización experimental de múltiples respuestas con una deseabilidad de 77.4%, arrojó las siguientes condiciones óptimas para las variables independientes: temperatura = 35.1 °C, pH = 5.0 y agitación = 139.3 rpm. Los resultados experimentales a resaltar entre las variables dependientes fueron: viabilidad = 10.1±0.1 Log10 CFU mL-1, producción biomasa = 3.2±0.2 g L-1 y velocidad específica de crecimiento = 0.24 h-1. En la 3ª fase se optimizaron experimentalmente las condiciones de proceso de una emulsión simple (W/O), considerando las variables independientes; tiempo de homogenización (HT) (1 – 5 min), balance hidrófilo lipófilo (HLBTotal) (4.7 – 6.7), concentración de emulsificantes (0.1 – 0.5 %) y concentración de aceite (30 – 50 %). Con el 70.1 % de deseabilidad en la optimización por múltiples respuestas se establecieron las siguientes condiciones óptimas; HT = 3.7 min, HLBtotal = 6.5, surfactantes = 0.47 % y aceite = 39.6 %. A partir de las condiciones óptimas de W/O se procedió a optimizar la formulación de una emulsión doble (W1/O)/W2, en la que se incorporó W. cibaria. Se utilizó un diseño central compuesto evaluando las variables independientes: tiempo de agitación (HT) (2 - 4 min), velocidad de homogenización (HS) (3000 - 5000 rpm), relación de mezcla de goma arábiga y gelatina (GA/G) (1.34 - 1.66) y relación másica de la emulsión simple W1/O (E1) y solución de hidrocoloides (W2) (0.43 - 0.66). Previamente, se determinó el punto de equivalencia de GA y G, obteniendo como resultado una relación de mezcla = 1.5 (GA/G). Las condiciones óptimas de las variables independientes fueron: HT = 3.1 min, HS = 3000 rpm, relación GA/G = 1.6 y E1/W2 = 0.5. Entre los resultados se destacó una alta viabilidad (10.5±0.1 Log10 CFU mL-1) y la obtención de gotas esféricas, dispersas y de tamaño variable. Seguidamente, se evaluó el proceso de coacervación compleja mediante un diseño unifactorial, considerándose el efecto del pH (3.5, 4.0 y 4.5) sobre las propiedades fisicoquímicas del coacervado y la viabilidad de W. cibaria. Se tomó la emulsión E1/W2 optimizada para la formación del coacervado, obteniendo los mejores resultados a pH = 4.0. Destacando alta viabilidad de W. cibaria (10.01±0.02 Log10 (CFU mL-1) y una morfología de partículas aglomeradas. Finalmente, en la 4ª fase los coacervados se liofilizaron y se evaluó la estabilidad de las microcápsulas durante el almacenamiento (1, 2, 3, 4, 5 y 6 meses) a diferentes condiciones de temperatura (5, 15 y 25 °C) mediante un diseño factorial completamente aleatorizado considerando las variables dependientes aw, humedad (%), solubilidad (%), higroscopicidad (%), índice de peróxidos (meqO2/kg muestra), viabilidad (Log10 CFU g-1) y simulación in vitro de digestión gastrointestinal (Log10 CFU g-1). Obteniendo en las cápsulas almacenadas a 5 °C la mayor viabilidad a los 180 días de almacenamiento (7.8±0.1 Log10 CFU g-1), garantizando unas propiedades fisicoquímicas adecuadas. En general, se resalta que a 5, 15 y 25 °C se mantiene el carácter probiótico de las microcápsulas de W. cibaria durante los 6 meses de almacenamiento. (texto tomado de la fuente) Commercial substrates have been commonly used for the production of bacterial biomass and its metabolites through lactic fermentation processes; however, the use of agro-industrial wastes as fermentation substrates for lactic acid bacteria (LAB) has been promoted as a possible alternative to reduce probiotic production costs. On the other hand, improving the viability of LAB has been a persistent challenge in the applications of microorganisms with probiotic potential in food. Therefore, different encapsulation technologies have been evaluated to protect bacterial cells and facilitate their application. In this context, the general objective of this research was to integrate the fermentation and encapsulation processes of the lactic acid bacterium Weissella cibaria using pineapple residues (epicarps and cores) and sacha inchi by-product as fermentation substrate, and combining double emulsion and complex coacervation technologies for encapsulation. Objective was developed in four phases. In the 1st phase, elemental, proximal, physical and chemical characterization of pineapple residues and sacha inchi by-product (SSI) was carried out for the formulation of a fermentation substrate (SFS). The SFS was hydrolyzed and used for the production of a lactic acid bacteria (Weissella cibaria). The results showed that pineapple and SSI residues were potential sources of macro- and micronutrients (carbohydrates, proteins and minerals). After the application of SFS in the fermentation process with W. cibaria, similar results were obtained when the commercial substrate (MRS) was used; biomass production (2.9±0.1 and 3.5±0.1 g L-1) and viability (9.8±3.2 and 9.9±2.7 Log10 CFU mL-1). In the 2nd phase, W. cibaria biomass production was optimized using response surface methodology, considering the independent variables: temperature (32 – 40 °C), pH (5.0 - 6.0), and agitation (100 - 150 rpm). The experimental optimization of multiple responses with a desirability of 77.4 % yielded the following optimal conditions for the independent variables: temperature = 35.1 °C, pH = 5.0 and agitation = 139.3 rpm. The experimental results to highlight among the dependent variables were: viability = 10.1±0.1 Log10 CFU mL-1, biomass production = 3.2±0.2 g L-1 and specific growth rate = 0.24 h-1. In the 3rd phase, the process conditions of a simple emulsion (W/O) were experimentally optimized, considering the independent variables; homogenization time (HT) (1 - 5 min), hydrophilic lipophilic balance (HLBTotal) (4.7 - 6.7), emulsifier concentration (0.1 - 0.5 %) and oil concentration (30 – 50 %). With 70.1 % desirability in the optimization by multiple responses, the following optimal conditions were established; HT= 3.7 min, HLBtotal = 6.5, surfactants = 0.47 % and oil = 39.6 %. Based on the optimal W/O conditions, we proceeded to optimize the formulation of a double emulsion (W1/O)/W2, in which W. cibaria was incorporated. A central composite design was used evaluating the independent variables: homogenization time (HT) (2 - 4 min), homogenization speed (HS) (3000 - 5000 rpm), gum arabic and gelatin mixing ratio (GA/G) (1.34 - 1.66) and mass ratio of the W1/O single emulsion (E1) and hydrocolloid solution (W2) (0.43 - 0.66). Previously, the equivalence point of GA and G was determined, obtaining a mixture ratio = 1.5 (GA/G). The optimum conditions for the independent variables were: HT = 3.1 min, HS = 3000 rpm, GA/G ratio = 1.6 and E1/W2 = 0.5. The results included high viability (10.5±0.1 Log10 CFU mL-1) and the production of spherical, dispersed and variable size droplets. Regarding morphology, spherical and dispersed droplets of variable size were observed. Next, the complex coacervation process was evaluated using a unifactorial design, considering the effect of pH (3.5, 4.0 and 4.5) on the physicochemical properties of the coacervate and the viability of W. cibaria. The E1/W2 emulsion optimized for coacervate formation was taken, obtaining the best results at pH = 4.0. High viability of W. cibaria (10.01±0.02 Log10 CFU mL-1 and an agglomerated particle morphology stood out. Finally, in the 4th phase, the coacervates were lyophilized and the stability of the microcapsules was evaluated during storage (1, 2, 3, 4, 5 and 6 months) at different temperature conditions (5, 15 and 25 °C). Using a completely randomized factorial design considering the dependent variables aw, moisture (%), solubility (%), hygroscopicity (%), peroxides index (meqO2/kg sample), viability (Log10 CFU g-1) and in vitro simulation of gastrointestinal digestion (Log10 CFU g-1). Obtaining in the capsules stored at 5 °C the highest viability at 180 days of storage (7.8±0.1 Log10 CFU g-1), ensuring adequate physico-chemical properties. In general, it is noted that at 5, 15 and 25 °C the probiotic character of the microcapsules of W. cibaria is maintained during the 6 months of storage. Doctorado Doctor en Biotecnología Aprovechamiento de Residuos Agroindustriales Alimentos funcionales Encapsulación de probióticos Área curricular Biotecnología