Identificazione e validazione di potenziali marcatori biologici nell’adenocarcinoma duttale del pancreas

Introduzione. L’adenocarcinoma duttale (PDAC) rappresenta circa l’85% delle neoplasie maligne pancreatiche. È un tipo di neoplasia molto aggressiva e ha prognosi infausta. Il PDAC è una malattia con una elevata mortalità, spesso diagnosticata in uno stadio avanzato per il quale esistono poche e inefficaci terapie. L’alta incidenza di ricadute locali unita alla precoce metastatizzazione sono le caratteristiche cliniche più tipiche di questo tumore. Inoltre la nota resistenza del tumore alla chemio e alla radioterapia limita l’efficacia di questi approcci terapeutici. Scopo. Identificare e validare nuovi marcatori biologici associati a caratteristiche di aggressività dell’adenocarcinoma pancreatico al fine di utilizzarli per comprendere proprietà biologiche del tumore stesso o in clinica per una corretta valutazione prognostica. Metodi e risultati. Abbiamo studiato n=17 linee cellulari umane immortalizzate di PDAC per alcune caratteristiche di aggressività cellulare: per la clonogenicità e la chemioresistenza alla gemcitabina in vitro e, in vivo, per la capacità di crescita in topi immunocompromessi (CD1-nude). Tutte le 17 linee cellulari sono state caratterizzate per l’espressione di classi di marcatori molecolari: recettori delle chemochine (CCR1-CCR10; CXCR1-CXCR6; CX3CR1; XCR1) e putativi marcatori staminali tumorali (ESA+CD24+CD44+; CD133+, CXCR4+) mediante citometria a flusso, secrezione di fattori solubili (n=48) tramite la tecnologia luminex e l’espressione di geni (n=11) coinvolti nello sviluppo pancreatico con Real Time PCR. Usando l’analisi statistica inter-linea (regressione lineare o di cox) abbiamo cercato una correlazione tra i fenotipi biologici e le caratteristiche di malignità cellulare individuando nuovi marcatori. Questi marcatori sono stati validati su tessuti tumorali primari in casistiche di pazienti affetti da PDAC: l’espressione del marcatore identificato è stata correlata con l’esisto clinico della neoplasia. In una prima analisi inter-linea n=35 fattori sono risultati statisticamente associati ad una o più caratteristiche di aggressività. È seguita una classificazione per priorità che, avvalendosi della sola correlazione con la tumorigenicità in vivo, ha ridotto a n=20 i fattori di rischio da validare. Abbiamo quindi approfondito lo studio su 4 marcatori molecolari di sviluppo pancreatico (ISL1, PDX1, PAX6, KRT19), sui fenotipi staminali e su 2 recettori delle chemochine (CCR5, CXCR3). L’espressione genica dell’mRNA di ISL1, PDX1, PAX6 e KRT19 è stata valutata in sezioni criostatiche di n=42 resezioni chirurgiche di pazienti affetti da PDAC. Non sono emerse correlazioni significative tra l’espressione di questi fattori e la sopravvivenza globale. Tuttavia alti livelli dell’mRNA di KRT19 predicono una progressione più precoce e di tipo metastatico. Più elevati livelli di PDX1 e PAX6 sono associati con una più alta probabilità di recidiva locale. Inoltre combinando i marcatori è stato individuato un fenotipo più aggressivo correlato con una minor sopravvivenza: si tratta dei pazienti che esprimono ad elevati livelli sia PDX1 che KRT19. La nostra strategia di screening ha mostrato essere fattori di rischio per lo sviluppo tumorale nel topo, non i classici fenotipi staminali descritti in letteratura (ESA+/CD24+/CD44+, CD133+, CD133+/CXCR4+) ma la combinazione ESA+/CD24-/CD44+ e la sola espressione di CXCR4 ed ESA: tuttavia la validazione clinica, condotta su una coorte di 39 pazienti affetti da adenocarcinoma duttale, non ha confermato che questi marcatori, né i classici già descritti, correlino in maniera statisticamente significativa con la sopravvivenza o con la progressione nel tempo e nemmeno con il sito di recidiva. Il fenotipo ESA+/CD24+/CD44- è invece risultato un fattore di rischio prognostico indipendente sia per la sopravvivenza (HR=4,166 p=0,001) che per la progressione (HR=2,208 p=0,019). CCR5 e CXCR3 sono risultati espressi su tessuti tumorali processati a fresco (n=6) ed analizzati in citometria a flusso a fronte di una negatività del pancreas di donatori d’organo (n=10). Essi sono espressi rispettivamente nell’11,9% e nel 17,6% delle cellule CA19.9+ del tumore, mentre solo nello 0,4% e il 0,34% nel tessuto sano. L’aumentata espressione di CCR5 e CXCR3 sembra essere una caratteristica tipica del PDAC. Conclusioni. La nostra strategia ha identificato marcatori biologici capaci di distinguere differenti comportamenti clinici del tumore in termini di progressione e sede di recidiva. La differente espressione di questi predittori potrebbe essere la causa di differenze biologiche che hanno un effetto sui meccanismi di progressione e diffusione tumorale. Al fine di confermare i nostri risultati stiamo realizzando un tissue microarray di resezioni chirurgiche di pazienti affetti da adenocarcinoma duttale. Inoltre in futuro il modello statistico sviluppato potrà essere applicato per testare ogni nuovo potenziale marcatore; caratterizzata la sua espressione sulle linee cellulari, si procederà con l’analisi inter-linea per verificare se sia un potenziale indicatore di aggressività in vitro o in vivo nel modello murino; quindi si potrà confermare il suo reale ruolo diagnostico, prognostico o predittivo in ambito clinico.