Microeléctrodos de fibra de carbono modificados com nanotubos de carbono para oximetria in vivo num modelo animal de epilepsia de lobo temporal

Trabalho de Projeto do Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentado à Faculdade de Ciências e Tecnologia A epilepsia é uma doença cerebral comum que afeta um número elevado de pessoas, trazendo inúmeras alterações à qualidade de vida dos pacientes. Diversos estudos têm sido feitos de forma a encontrar formas de manter a doença controlada e providenciar às pessoas afetadas um estilo de vida mais independente, dado que esta ainda é uma doença incurável e é difícil controlar as convulsões. A região do cérebro mais epileptogénica é o lobo temporal e por isso, a epilepsia do lobo temporal é a forma mais comum de epilepsia, sendo também uma das mais difíceis de controlar.Apesar de apenas representar apenas 2% do peso total do corpo, o cérebro humano requer uma quantidade elevada de substratos metabólicos para satisfazer as suas necessidades, consumindo sensivelmente 20% do oxigénio que entra no organismo. É assim dependente de um sistema vascular eficiente que fornece a energia necessária para manter o equilíbrio homeostático do cérebro. Apesar de necessitar de elevadas quantidades de energia, o cérebro carece de uma forma de reservar nutrientes para quando são necessárias reservas metabólicas de modo a satisfazer as necessidades energéticas. Para fazer frente a esta adversidade, o cérebro conta com os nutrientes presentes na corrente sanguínea que têm de ser distribuídos de forma precisa e exata, ajustando o fluxo cerebral sanguíneo consoante o nível de atividade cerebral- acoplamento neurovascular. O oxigénio molecular é fundamental ao bom funcionamento do cérebro, e os mecanismos que controlam o seu uso e distribuição são vitais para preservar o equilíbrio homeostático do cérebro. Para além do seu papel fulcral na respiração celular, onde este é o recetor de eletrões final da cadeia respiratória mitocondrial, o oxigénio também é ainda necessário para a produção de espécies reativas de oxigénio que desempenham um papel importante de sinalização na regulação do fluxo sanguíneo cerebral. O incremento da atividade neuronal numa região especifica do cérebro está associado a um aumento do fluxo sanguíneo bem como a uma alteração do consumo de oxigénio.Deste modo, a investigação focada no desenvolvimento de novas técnicas de oximetria, de maneira a aferir a pO2 in vivo em tempo real, têm um potencial para permitir uma melhor compreensão de como o oxigénio afeta diversos estados metabólicos e de doença, assim como na procura de um tratamento e alternativas terapêuticas utilizando os dados adquiridos.Neste projeto, construímos microeléctrodos de fibra de carbono (CFM) revestidos com nanotubos de carbono de múltiplas paredes (MWCNT) numa matriz de Nafion® para monitorização in vivo do pO2 no cérebro. Estes microeléctrodos alterados foram avaliados quanto à sua performance eletroanalítica relativamente à eletroredução do oxigénio e testados no que toca à sua habilidade de medir corretamente alterações dinâmicas no pO2 in vivo num modelo de convulsões provocadas por 4-aminopiridina. Para além disto, também foi explorada a capacidade da amperometria de alta frequência como forma de medir simultaneamente a pO2 e informação eletrofisiológica na forma de correntes do potencial local de campo. O principal objetivo foi o de estudar as alterações no cérebro ao nível do pO2 do tecido durante eventos com convulsões no hipocampo, uma estrutura altamente afetada pela epilepsia do lobo temporal.Estes resultados vão de encontro com a noção de que os MWCNT possuem um efeito eletrocatalítico, diminuindo o potencial excessivo necessário para a detenção e monitorização eletroquímica do O2, aumentando a sensibilidade, quando comparados a CFM sem revestimento, para potenciais de trabalho entre -0,5 e -0,8 V vs. Ag/AgCl. Em relação aos estudos in vivo, constatámos que as convulsões induzidas por 4-aminopiridina produzem alterações bifásicas na pO2 do tecido cerebral que foram visivelmente relacionados com um aumento da atividade neuronal observada no aumento da potência em frequências acima dos 1 Hz.Este estudo confirma os benefícios dos MCNT para efetuar medições de oxigénio in vivo com CFM, demonstrando ainda a aptidão destes elétrodos para efetuar medições de variações de oxigénio, assim como resultados que corroboram outros estudos realizados com outros convulsivantes químicos que demonstraram a queda inicial na concentração de oxigénio ( “epileptic dip”) seguida de uma fase de hiperoxigenação, demonstrando o sucesso e potencial que esta técnica tem para adquirir novos dados com o objetivo de poder alcançar um melhor controlo das crises epiléticas. Epilepsy is one of the most common and serious brain diseases which affects a large number of people, provoking diverse lifestyle consequences and limitations. It is many times hard to treat/control with medication and worldwide efforts have been undertaken to achieve disease control, which may allow patients to attain an independent lifestyle. The most common form of acquired epilepsy is temporal lobe epilepsy, since the temporal lobe is the most epileptogenic region of the human brain, also being one of the most common and intractable types of epilepsy that usually results from a trauma and only manifests its symptoms later in life.The human brain is a highly complex and metabolically active organ, and as such an advanced and efficient vascular system is needed to meet the energetic demands in order to preserve the homeostatic balance of the brain. Even though this organ only makes up 2% of the overall body mass, it requires a high input of metabolic substrates to fulfil its needs, consuming about 20% of the total oxygen intake. Despite spending such a large amount of energy, the brain does not possess a way to store nutrients to use when needed. These necessities are suppressed by the blood supply and accurate and precise adjustment of cerebral blood flow as a function of activity level – neurovascular coupling. Compromised neurovascular coupling is associated with several disease states, including epilepsy.Molecular oxygen plays a crucial role in maintaining a healthy brain function, and the mechanisms that control its usage and delivery are vital to preserve normal brain homeostasis. Besides its critical role in cellular respiration, where it is the terminal electron receptor of the mitochondrial respiratory chain, it originates reactive oxygen species that play an important signalling role in the regulation of the cerebral blood flow. Increased neuronal activity in a specific region of the brain is associated to an increment in cerebral blood flow as well as a change in oxygen consumption.Considering this data, research on oximetry techniques, assessing brain pO2 in vivo and in real time, is of considerable value to comprehend how oxygen affects various metabolic and disease states, as well as aiming to achieve treatment and therapy alternatives using the gathered data. In this project we constructed carbon fibre microelectrodes (CFM) coated with multi-walled carbon nanotubes (MWCNT) in a Nafion® matrix for in vivo monitoring of pO2 in the brain. These MWCNT-modified CFM were evaluated for their electroanalytical performance towards the electroreduction of oxygen and tested for their ability to adequately monitor dynamic changes in pO2 in vivo in a model of 4-aminopyridine evoked seizures. Furthermore, we explored the capability of high-frequency amperometry to concurrently allow the measurement of pO2 and electrophysiological data in the form of local field potential-related currents. The main goal was to study the changes in brain tissue pO2 during paroxysmal events such as convulsive seizure in the hippocampus, a structure that is greatly impacted in Temporal Lobe Epilepsy. The results support the notion that MWCNT coating has an electrocatalytic effect, lowering the overpotential needed for electrochemical reduction and monitoring of O2 and increasing sensitivity as compared to bare CFM for working potentials between -0.5 and -0.8 V vs. Ag/AgCl. Regarding the in vivo studies, we found that 4-aminopyridine-evoked seizures produced biphasic changes in brain tissue pO2 that were clearly correlated with increased neuronal firing observed as an increase in power at frequencies above 1 Hz. This study confirms the benefits of MWCNT for oxygen measurements with CFM, the suitability of these electrodes for in vivo oxygen recording and also shows results that corroborate other studies with different chemoconvulsants that show the epileptic dip followed by a hyperoxygenation phase, showing the success and potential of this approach to acquire new data allowing better control of epileptic seizures. FCT FCT Outro - LA/P/0058/2020POCI-01-0145-FEDER-02826 Outro - POCI-01-0145-FEDER-028261