Microengineered 3D in vitro model of human pulmonary alveoli: Curvature's influence on lung epithelial cells

Trabalho de Projeto do Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentado à Faculdade de Ciências e Tecnologia A engenharia de tecidos visa criar modelos in vitro de tecidos e estruturas biológicas funcionais recorrendo a diferentes tecnologias, conforme o objectivo final. Uma estratégia importante para adquirir um bom conhecimento do funcionamento dos órgãos humanos e da sua interações enquanto sistema biológico passa por devenvolver modelos in vitro que representem, da melhor forma possível, a sua anatomia e fisiologia.Desenvolvimento de um modelo 3D in vitro de alvéolo humano por microengenharia. Cavidades com semelhança de forma e dimensional à do órgão a ser modelado foram formadas em policarbonato por microthermoforming assistido por gás. Porosidade destas membranas foi introduzida por ion track etching. e forma a alcançar uma estrutura para a cavidade o mais semelhante possível ao alvéolo humano, diferentes parâmetros para optimização do microthermoforming assistido por gás e do ion track etching foram testados. A avaliação do impacto que a curvatura poderá ter em células epiteliais de pulmão baseou-se na análise de resultados obtidos para proliferação celular, apoptose, densidade celular, adesão célula-substrato, interacção célula-célula e teste de actividade metabólica. A caracterização destes resultados foi efectuada por marcação de estruturas específicas com anticorpos, microscópio electrónico de varrimento (MEV) e por microscopia laser de varrimento (3D profilómetro). Após desenvolvida a plataforma porosa com curvatura, células epiteliais de alvéolo pulmonar humano foram cultivadas. Avaliação de actividades celulares como proliferação, apoptose, densidade celular, adesão celular, actividade metabólica e interacção célula-célula, as quais foram quantificadas. Desenvolvimento e estudo preliminar de uma interface ar-líquido com a curvatura referida, aproximando mais o modelo à barreira ar-sangue responsável pela troca gasosa a nível alveolar. Tissue engineering aims to create functional tissues and in vitro biological structures using different technologies, approaches and to address different goals. An important strategy to have a better understanding of human organs and their interactions is by developing in vitro models that represent their anatomy and physiology. Development of a microengineered 3D in vitro model of human alveoli. Cavities similar to the shape and dimensions of human alveoli were created in polycarbonate by gas-assisted microthermoforming. Porosity in these membranes was introduced by ion track etching. Different parameters were tested to optimise gas-assisted microthermoforming and ion track etching in order to achieve a structure that was as close as possible to the human alveoli' dimensions and shape. To assess the impact of substrate’s curvature on epithelial cells, proliferation, apoptosis, cell density, cell-substrate adhesion, cell-cell interaction and metabolic activity assays were performed. Samples were analysed and characterised by specific immunostainings by respective fluorescent imaging, by scanning electron microscope (SEM) and by laser scanning microscope profilometer. After achieving the desired design for the cavities, lung epithelial cells were cultured and their basic activities were analysed and quantified such as proliferation, apoptosis, cell density, metabolic activity, cell-cell interaction and cell-substrate adhesion. Trial of an Air-Liquid Interface (ALI) and preliminary study of cell barrier intefrity and epithelial cells differentiation when exposed to air, mimicking the air-blood barrier responsible for gas exchange in the human alveoli.