Morfo-anatomia dello sviluppo del seme in Coffea arabica L. cv. Mundo Novo

2007/2008 Questo lavoro mirato allo studio dello sviluppo del seme di Coffea arabica, avvalendosi di differenti tecniche microscopiche, ha cercato di dare un contributo agli studi effettuati precedentemente da Houk (1938), Mendes (1941), Dedecca (1957), Wormer (1966), Dentan (1977, 1985) e De Castro (2002, 2005) che hanno apportato nozioni fondamentali a riguardo. Il campionamento del materiale è stato effettuato da settembre 2006 a giugno 2007 su piante appartenenti al cv. Mundo Novo, all’Instituto Agronômico di Campinas (IAC, SP, Brasil). Sono stati raccolti quindi circa 60 campioni per ciascun stadio di sviluppo a scadenza bisettimanale dal momento della fioritura fino a completa maturazione del frutto, per un totale di 34 settimane after anthesis (AA). I campioni sono stati quindi subito fissati e spediti in laboratorio a Trieste (Italia). Per prima cosa è stata effettuata l’analisi dimensionale delle drupe su un pool di campioni scelto casualmente tra quelli arrivati in laboratorio usando un calibro digitale lungo tre linee di misura: lunghezza, asse maggiore e asse minore in millimetri, sia per le drupe che per i semi. I campioni selezionati sono stati inclusi in resina Technovit 7100 (dall’inizio della fioritura fino alla 20a settimana AA) e tagliati con un microtomo rotativo (sezioni da 6 µm). I campioni dalla 22a settimana in poi sono stati tagliati invece con un criostato a bassa temperatura (da -15°C a -25°C; sezioni da 10-12 µm), a causa dell’aumento della durezza del materiale. Sulle sezioni preparate sono state usate tecniche standard di osservazione in microscopia (ottica, SEM e TEM) e colorazioni istochimiche (ad es. Toluidin blue-O, Periodic Acid Schiff, DAPI etc.) ed è stata effettuata una messa a punto di protocolli specifici secondo la tipologia di tessuto osservata. I risultati dell’analisi dimensionale hanno permesso di distinguere tre fasi di crescita dei frutti: 1. fase di quiescenza fino a 4 settimane dopo la fioritura (‘after anthesis’, AA); 2. fase centrale di sviluppo rapido (da 6 a 14 settimane AA); 3. fase di maturazione (da 16 settimane AA in poi). La seconda fase è strettamente correlata alle condizioni climatiche del periodo, in particolare all’aumento della frequenza delle piogge. Nella fase di crescita lenta l’ovario osservato in sezione longitudinale presenta la tipica struttura della drupa del caffè con due camere ovariche che ospitano un ovulo anatropo ciascuna. L’ovulo è composto da un funicolo, da un unico tegumento proveniente dal tessuto materno e da una zona di pochi micron occupata dal sacco embrionale non ancora sviluppato. E’ presente anche l’‘otturatore’ che, in Coffea, è di derivazione funicolare, formato da parenchima, conduce il tubetto pollinico al micropilo. Dopo circa un mese (4a -6a settimana) non si evidenzia ancora una crescita dimensionale del seme degna di nota. Durante la fase centrale di sviluppo rapido il mesocarpo si accresce fino ad uno spessore di 0,6 mm. A 8 settimane il seme ha 2 mm e il sacco embrionale fecondato ha iniziato il suo sviluppo con l’accrescimento dell’endosperma, inizialmente di tipo nucleare. A 10 settimane il seme ha 3 mm. Il sacco embrionale è più grande (0,2 mm) ed è formato da circa una ventina di cellule dell’endosperma. A 12 settimane il seme raggiunge i 10 mm. L’endosperma ha circa 1 mm. In questo stadio si nota un particolare strato tissutale che rappresenta la parte del perisperma che diventerà pellicola argentea. In seguito inizia ad intravedersi la pellicola argentea, con alcune cellule ancora vive e nucleate, e il pergamino si sta formando grazie a particolari modificazioni dell’endocarpo della drupa. Il seme ha quasi raggiunto la sua dimensione definitiva, alla 14a settimana. Nella fase di maturazione la crescita dimensionale non è più così degna di nota, mentre si osservano cambiamenti chimici e strutturali. La 16a settimana è caratterizzata dalla quasi completa formazione della pellicola argentea, anche all’interno del solco. Molte cellule dell’endosperma sono in attività mitotica continua. Il pergamino invece è completamente formato a 18 settimane, caratterizzato da fibre fusiformi a pareti spesse. Dalla 20a settimana in poi, il tessuto dell’endosperma ormai formato ha ancora le cellule a pareti sottili (3 µm). In questa fase delicata il materiale ha caratteristiche intermedie, né duro né molle; il contenuto vacuolare delle cellule endospermiche si arricchisce di corpi proteici e strutture zuccherine, evidenziate con diverse colorazioni. L’embrione è formato e anche le sue cellule sono ricche di corpi proteici, evidenziati soprattutto con la colorazione UV-Schiff e l’osservazione in fluorescenza. Le cellule dell’endosperma alla 26a settimana hanno un contenuto vacuolare ancora ricco di proteine e le pareti diventano più spesse (4-6 µm). Si osserva la formazione di alcune nodosità (Dentan, 1977) tipiche delle pareti cellulari dell’endosperma, soprattutto vicino alla cavità embrionale. Lo sviluppo del seme completo viene raggiunto alla 30a settimana, stadio in cui anche l’embrione sembra aver concluso la propria maturazione. Le pareti cellulari hanno raggiunto il loro spessore definitivo (da 6 a 10 µm). Infine, all’ultimo stadio (34 settimane AA), le cellule presentano un aspetto differente, risultano quasi più svuotate ed è difficile osservare i componenti cellulari con le colorazioni utilizzate fino ad ora. La maggior parte delle pareti presentano nodosità. Queste caratteristiche rappresentano uno stadio di sovra-maturazione della drupa. Oltre agli aspetti puramente morfo-anatomici, l’abilità di sezionare i tessuti seminali potrebbe essere di grande importanza per eventuali analisi biomolecolari di espressione genica, come già è stato in parte studiato recentemente (De Castro & Marraccini, 2006). Conoscere infatti gli stadi di sviluppo e i tessuti coinvolti in ciascuna fase, dà la possibilità di evitare errori grossolani di interpretazione dei risultati e di stabilire relazioni interessanti fra la parte genetica e le osservazioni in microscopia. XXI Ciclo 1975