Aufbau und Evaluierung eines Chemilumineszenz-Immunoassays zur Bestimmung von 17a-Hydroxyprogesteron im Serum mittels eines 7a-biotinylierten 17a-Hydroxyprogesterontracers

Wir entwickelten ein neues Immunoassay-Konzept zur Bestimmung von Steroiden im Serum mittels eines biotinylierten Steroidtracers. Es handelt sich hierbei um einen kompetitiven Enzymimmunoassay, die Signalgenerierung erfolgt mittels an Streptavidin gekoppelter Meerrettichperoxidase. Dieser Assay zur Bestimmung von 17a-Hydroxyprogesteron (17aOHP) im Serum verwendet 17a-Hydroxypregn-4-ene-3-one-7a(biotinyl-6-N-unde-cyclamid) als Tracer und einen für die Position 7 spezifischen polyklonalen Kaninchen anti-17a-OHP Antikörper. In Verdrängungsexperimenten konnte gezeigt werden, daß 7a-Bio-17aOHP das mit Tritium markierte 17aOHP adäquat vom Antikörper verdrängt. Für die Durchführung des Assays werden die Serumproben mittels C18-Kartuschen extrahiert und in steroidfreiem Serum wieder aufgenommen. Der 7a-Bio-17aOHP -Tracer (20 nmol/l endgültige Konzentration) wird zusammen mit dem für die Position 7 spezifischen polyklonalen Kaninchen anti-17a-OHP Antikörper in Mikrotiterwells inkubiert, welche mit einem zweiten Ziege- anti- Kaninchen- Antikörper beschichtet sind. Die Signalgenerierung erfolgt durch an Streptavidin gekoppelte Meerrettichperoxidase, wobei die Enzymaktivität mittels einer verstärkten Chemilumineszenz Methode quantifiziert wird. Der Assay mißt 17aOHP in einer Spannbreite von 0,12 bis 30 nmol/l; die untere Nachweisgrenze liegt bei 0,08 nmol/l. Die Intraassay-Präzision liegt zwischen 9,8 und 26,9%. Die Wiederfindung von Serumproben zugefügtem 17aOHP liegt zwischen 85 und 110 %. Außerdem bietet der Assay eine hervorragende Linearität bei Verdünnung. Es wird keine nennenswerte Kreuzreaktivität mit anderen Steroidhormonen gefunden. Der Referenzbereich liegt für Männer bei 2,16 - 3,1 nmol/l; für prämenopausale Frauen in der Follikelphase bei 1,35 - 2,97 nmol/l, in der Lutealphase bei 2,13 - 3,97 nmol/l. Bei Schwangeren im I. und II. Trimenon ermittelten wir Werte zwischen 3,97 und 8,19 nmol/l. Gemessen werden Proben von behandelten und unbehandelten Kindern mit Adrenogenitalem Syndrom (21-Hydroxylasemangel). Die gefundenen Werte stimmen mit Werten aus der Literatur überein. Im Methodenvergleich mit einer RIA-Methode wird folgende Korrelation gefunden: y = -0,15 + 0,47 x; rs = 0,675 für die Frauenseren und y = 0,44 + 0,35 x; rs = 0,786 für die Männerseren. Die Korrelation mit einem ELISA ergiebt: y = -0,08 + 0,71 x; rs = 0,793 für die Frauenseren; y = 0,34 + 0,46 x; rs = 0,888 für die Männerseren. Die Ergebnisse zeigen, daß der Chemilumineszenz-Immunoassay die Voraussetzungen für die Bestimmung von 17aOHP im Serum erfüllt. Zum Einsatz bei der Diagnostik des Adrenogenitalen Syndroms ist er gut geeignet. We developed a novel immunoassay concept for the determination of steroids in serum using biotinylated steroids as the tracer. Assays are formatted as competitive enzyme immunoassays, signalling is performed by applying streptavidin-conjugated horseradish peroxidase (sAv-HRP). Latest example of this concept is the established chemiluminescence immunoassay (CLIA) for 17a-hydroxyprogesterone (17-OHP) in human serum using the 17-OHP derivative 17a-hydroxypregn-4-ene-3-one-7a(biotinyl-6-N-undecyclamide) (7a-Bio-17-OHP) as tracer and a position 7-specific polyclonal rabbit anti-17-OHP antibody. In displacement experiments it could be demonstrated that 7a-Bio-17-OHP adequately displaces tritiated 17-OHP from the antibody in the anticipated way. For the assay run, serum samples are extracted by use of C18-cartridges and redissolved in steroid free serum. The 7a-Bio-17-OHP tracer (20 nmol/l final concentration) was incubated together with a position 7-specific rabbit polyclonal anti-17-OHP antibody in microtiter wells, coated with a second ant-rabbit antibody. Signal generation was performed using a sAv-HRP conjugate, the enzyme activity being quantified by an enhanced chemiluminometric method. Assay dynamic range is from 0.12 to 30 nmol/l; lower detection limit is found with 0.08 nmol/l in serum. The intraassay-precision is between 9,8 und 26,9%. Recoveries of added 17-OHP to samples of 85-110 % and an excellent dilution linearity can be demonstrated. There is no remarkable cross-reactivity with any of the used steroid hormones. Reference values for men are 2,16 - 3,1 nmol/l; for premenopausal women in the follicular phase 1,35 - 2,97 nmol/l, in the luteal phase 2,13 - 3,97 nmol/l. During pregnancy in the I. and II. trimenon values were 3,97 und 8,19 nmol/l. We measured serum samples of children with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. The results were equivalent to values found in literature. In comparison with a RIA-method the following correlation is found: y = -0,15 + 0,47 x; rs = 0,675 for the samles of women and y = 0,44 + 0,35 x; rs = 0,786 for the samles of men. The correlation with an ELISA is: y = -0,08 + 0,71 x; rs = 0,793 for the samples of women; y = 0,34 + 0,46 x; rs = 0,888 for the samples of men. We conclude that this new assay may be a versatile nonisotopic immunoassay method for the determination of 17-OHP in serum.