Strategie analitiche innovative per lo sviluppo di sistemi sensoristici e metodi in spettrometria di massa

Il lavoro presentato in questa tesi di Dottorato è incentrato sullo sviluppo di strategie analitiche innovative basate sulla sensoristica e su tecniche di spettrometria di massa in ambito biologico e della sicurezza alimentare. Il primo capitolo tratta lo studio di aspetti metodologici ed applicativi di procedure sensoristiche per l’identificazione e la determinazione di biomarkers associati alla malattia celiaca. In tale ambito, sono stati sviluppati due immunosensori, uno a trasduzione piezoelettrica e uno a trasduzione amperometrica, per la rivelazione di anticorpi anti-transglutaminasi tissutale associati a questa malattia. L’innovazione di questi dispositivi riguarda l’immobilizzazione dell’enzima tTG nella conformazione aperta (Open-tTG), che è stato dimostrato essere quella principalmente coinvolta nella patogenesi. Sulla base dei risultati ottenuti, entrambi i sistemi sviluppati si sono dimostrati una valida alternativa ai test di screening attualmente in uso per la diagnosi della celiachia. Rimanendo sempre nel contesto della malattia celiaca, ulteriore ricerca oggetto di questa tesi di Dottorato, ha riguardato lo sviluppo di metodi affidabili per il controllo di prodotti “gluten-free”. Il secondo capitolo tratta lo sviluppo di un metodo di spettrometria di massa e di un immunosensore competitivo per la rivelazione di prolammine in alimenti “gluten-free”. E’ stato sviluppato un metodo LC-ESI-MS/MS basato su un’analisi target con modalità di acquisizione del segnale selected reaction monitoring per l’identificazione di glutine in diversi cereali potenzialmente tossici per i celiaci. Inoltre ci si è focalizzati su un immunosensore competitivo per la rivelazione di gliadina, come metodo di screening rapido di farine. Entrambi i sistemi sono stati ottimizzati impiegando miscele di farina di riso addizionata di gliadina, avenine, ordeine e secaline nel caso del sistema LC-MS/MS e con sola gliadina nel caso del sensore. Infine i sistemi analitici sono stati validati analizzando sia materie prime (farine) che alimenti (biscotti, pasta, pane, etc.). L’approccio sviluppato in spettrometria di massa apre la strada alla possibilità di sviluppare un test di screening multiplo per la valutazione della sicurezza di prodotti dichiarati “gluten-free”, mentre ulteriori studi dovranno essere svolti per ricercare condizioni di estrazione compatibili con l’immunosaggio competitivo, per ora applicabile solo all’analisi di farine estratte con etanolo. Terzo capitolo di questa tesi riguarda lo sviluppo di nuovi metodi per la rivelazione di HPV, Chlamydia e Gonorrhoeae in fluidi biologici. Si è scelto un substrato costituito da strips di carta in quanto possono costituire una valida piattaforma di rivelazione, offrendo vantaggi grazie al basso costo, alla possibilità di generare dispositivi portatili e di poter visualizzare il risultato visivamente senza la necessità di strumentazioni. La metodologia sviluppata è molto semplice, non prevede l’uso di strumentazione complessa e si basa sull’uso della isothermal rolling-circle amplification per l’amplificazione del target. Inoltre, di fondamentale importanza, è l’utilizzo di nanoparticelle colorate che, essendo state funzionalizzate con una sequenza di DNA complementare al target amplificato derivante dalla RCA, ne permettono la rivelazione a occhio nudo mediante l’uso di filtri di carta. Queste strips sono state testate su campioni reali permettendo una discriminazione tra campioni positivi e negativi in tempi rapidi (10-15 minuti), aprendo una nuova via verso nuovi test altamente competitivi con quelli attualmente sul mercato. The work presented in this PhD thesis is focused on the development of innovative analytical strategies based on sensor technology and mass spectrometry techniques in biological field and food safety. The first chapter deals on the study of methodological aspects and applications of sensing procedures for the identification and determination of biomarkers associated with celiac disease. In this context, a piezoelectric and amperometric immunosersor have been developed for the detection of anti-tissue transglutaminase antibodies associated with this disease. The innovation of these devices concerns the immobilization of the enzyme tTG in its open conformation (Open-tTG), which has been shown to be the one mainly involved in the pathogenesis. On the basis of the results, both systems are a good alternative to the screening tests currently in use for the diagnosis of celiac disease. In the context of the research theme aimed at developing new methods for the diagnosis of celiac disease, a further research objective of PhD thesis was the development of reliable methods for the control of gluten-free products. For this purpose, the second chapter deals on the development of mass spectrometry-based methods and of a competitive immunosensor for the detection of prolamines in gluten-free foods. A targeted proteomic LC-ESI-MS/MS-based method for simultaneous determination of gluten from different celiotoxic cereals on foods, was developed. In addition, the attention was focused on a competitive immunosensor as a screening rapid method for the detection of gliadin in flours. Both systems have been optimized using mixtures of rice flour fortified with gliadins, avenins, hordeins and secalins in case of LC-MS/MS analysis and just with gliadins in case of the sensor. Finally, these systems have been validated by analyzing both raw materials (flours) and food samples (biscuits, pasta, bread, etc.). The mass spectrometry approach opens the way to the possibility to perform a MS-based multiplex screening for the assessment of gluten-free products safety, but further studies should be conducted to investigate extraction conditions compatible with the competitive immunoassay that so far can just be used for the analysis of flours extracted with ethanol. The third chapter of this thesis concerns the development of new methods for the detection of HPV, Chlamydia and Gonorrhoeae in biological fluids. It has been chosen a strip of paper as a substrate which can constitute a valid detection platform, offering advantages due to the low cost, the ability to generate mobile devices and allows the visualization of results without instrumentations. The developed methodology is very simple, does not require the use of complex instrumentation and is based on the use of isothermal rolling circle amplification to amplify the target. Furthermore, of fundamental importance, is the use of nanoparticles with intrinsic coloration functionalized with a DNA sequence complementary to the amplified target deriving from RCA, because they allow the visualization by naked eye through the use of paper filters. These strips were tested on real samples allowing discrimination between positive and negative samples in a short time (10-15 minutes), opening the way to new and highly competitive assays with those currently available.