Detection and quantification of cell-free Nucleic Acids (cfNAs) in blood samples of patients with Acute Myeloid Leukaemia (AML): protocol optimization

Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada (especialização em Biomedicina)
O sistema hematopoiético possui uma elevada capacidade regenerativa das células sanguíneas. Mutações em proto-oncogenes ou genes supressores de tumor incitam uma proliferação descontrolada de células-tronco e, consequente acumulação de blastos imaturos e anormais na medula óssea, podendo resultar no desenvolvimento de leucemia. Neste trabalho será dada especial atenção à Leucemia Mieloide Aguda (LMA), um subtipo de leucemia. LMA é um cancro agressivo no sangue que compreende a leucemia aguda mais comum em adultos. Nos últimos anos, a investigação tem sido direcionada para a obtenção de biomarcadores, através de métodos não invasivos, que possam estar presentes no sangue periférico dos pacientes. Particularmente, os Ácidos Nucleicos livres de células (cfNAs), que circulam na corrente sanguínea livres ou associados a Vesículas Extracelulares (VEs), especialmente exossomas, emergiram como potenciais biomarcadores. Os cfNAs são porções de DNA e RNA libertados na corrente sanguínea que, quando presentes em concentrações superiores, podem indicar uma manifestação de cancro, fornecendo informações sobre a carga tumoral e a progressão maligna. Assim, a deteção e quantificação de cfNAs parece ser uma abordagem promissora para uma “biópsia líquida” não invasiva no diagnóstico e monitorização de neoplasias hematológicas. O principal objetivo desta dissertação foi o de desenvolver um protocolo otimizado para deteção de cfNAs. Com isso, pretendeu-se avaliar variações no perfil de cfNAs entre amostras de sangue de pacientes com LMA e de doadores saudáveis. De facto, foi possível uma deteção de cfNAs em amostras de sangue de pacientes com LMA. Mais ainda, verificou-se que o perfil de RNA de amostras de sangue de pacientes com LMA é diferente do de doadores saudáveis. Posteriormente, a análise dos níveis de expressão de miR-142-3p, um microRNA humano específico que está envolvido na regulação da hematopoiese, revelou que este microRNA apresenta níveis inferiores nas amostras de sangue de pacientes com LMA. Estes dados são concordantes com a literatura, uma vez que está descrito que o sangue periférico de pacientes com LMA apresenta uma desregulação da hematopoiese em relação a dadores saudáveis. Porém, pesquisas adicionais serão necessárias para elucidar inteiramente a participação dos cfNAs na LMA.
Hematopoietic system has high capacity to regenerate blood cells. Mutations in proto-oncogenes or tumour suppressor genes incite an uncontrolled proliferation of stem cells and consequently accumulation of immature and abnormal blast cells in the bone marrow. Thus, an insufficiency of hematopoietic system can trigger the development of leukaemia. Here, will be given special attention to Acute Myeloid Leukaemia (AML), a subtype of leukaemia. AML is an aggressive blood cancer which comprises the most common acute leukaemia in adults. In the last years, there has been a need for a non-invasive blood-based biomarker for diagnosis and monitoring relapse of cancer. Particularly, cell-free nucleic acids (cfNAs), which circulate in the bloodstream freely or associated with Extracellular Vesicles (EVs), particularly exosomes, have emerged as potential biomarkers. The cfNAs are DNA and RNA fragments released into the bloodstream that when present in higher concentrations can provide the indication of a cancer manifestation, giving information about tumour burden and the malignant progression. Hence, the detection and quantification of cfNAs appears to be a promising approach for a non-invasive “liquid biopsy” in diagnosis and relapse monitoring of haematological malignancies, especially for AML. The main objective of this master thesis was to develop an optimized protocol to increase the sensibility of cfNAs detection. With this, it is intended to evaluate variations in cfNAs profile between peripheral blood samples of AML patients and healthy donors. In fact, a detection of cfNAs in blood samples of AML patients was possible with a high-level sensibility detection. Importantly, data presented here demonstrate a clearly different RNA profile among blood samples of AML patients and healthy individuals. Then, in a posteriorly analysis of miR-142-3p, a specific human microRNA which is involved in the haematopoiesis regulation, was also performed. The preliminary results revel that miR-142-3p was downregulated in blood samples from AML patients. These data are concordant with previous reports since that peripheral blood of AML patients have a dysregulation of haematopoiesis in relation to healthy donors. However, additional research will be needed to be entirely elucidated the participation of cfNAs in AML.
O apoio financeiro foi prestado através da Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) – projetos UIDB/50026/2020, UIDP/50026/2020, POCI-01-0145-FEDER-028159 e POCI-01-0145-FEDER-030782, através dos projetos NORTE-01-0145-FEDER-000055 e NORTE-01-0145-FEDER-000039, apoiado pelo Programa Operacional Regional Norte Portugal (NORTE 2020), no âmbito do Acordo de Parceria PORTUGAL 2020, através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e do ICVS Scientific Microscopy Platform, member of the national infrastructure PPBI - Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01- 0145-FEDER-022122).