Evaluation of novel purine and pyrimidine derivatives as fluorescent tools for biological applications

Dissertação de mestrado em Applied Biochemistry
Análogos de nucleósidos fluorescentes têm sido amplamente utilizados para fins científicos e biomédicos devido às suas propriedades fotofísicas. Especificamente, estes análogos podem podem interagir com a maquinaria celular devido a semelhanças estruturais e químicas com biomoléculas endógenas, proporcionando meios para explorar as interações alvo ligante, bem como marcar proteínas, ácidos nucleicos e organelos com fluorescência. Novos derivados fluorescentes de purina e pirimidina exibindo propriedades fotofísicas e fotoquímicas interessantes, como elevado rendimento quântico, grande desvio de Stokes e comprimentos de onda de absorção e emissão na região visível do espectro, foram sintetizados. Estas características fazem delas moléculas promissoras para serem usadas como sondas fluorescentes para aplicações biológicas. Neste trabalho, trinta e dois derivados de purina e pirimidina foram avaliados pelas suas capacidades de sondagem fluorescente, usando Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo. O impacto destas moléculas na proliferação celular foi avaliado num ensaio de cultura líquida. A maioria dos compostos não interferiu nas taxas de crescimento da levedura a 500 µM, com exceção de alguns casos particulares. Estudos anteriores indicaram uma possível interação entre estes derivados de purina e pirimidina e a V-ATPase. Para explorar esta possibilidade, um ensaio de atividade de ATPase foi realizado. Um dos compostos selecionados para este ensaio exibiu inibição significativa de ATPase. Um estudo de seguinte visou determinar o efeito destas moléculas no tempo de vida da levedura, uma vez que a atividade normal da V-ATPase é necessária para um tempo de vida prolongado. De nove compostos testados, oito aumentaram substancialmente o tempo de vida da levedura, enquanto um reduziu ligeiramente. A microscopia de epifluorescência foi usada para avaliar o potencial de marcação fluorescente das moléculas em estudo, em diferentes condições, revelando diversos padrões de marcação desde o acumular no lúmen do vacúolo até à marcação da membrana vacuolar e possivelmente o retículo endoplasmático, aparelho de Golgi e vesículas endocíticas. Alguns compostos também foram avaliados com diferentes técnicas de fixação e os resultados obtidos sugerem que os compostos se localizam nos referidos organelos por um mecanismo que requer atividade metabólica. Além disso, um composto mostrou-se um promissor corante de viabilidade, uma vez que apresentou um comportamento idêntico ao iodeto de propídio num ensaio de fluorescência células vivas/mortas. Docking molecular foi usado para fornecer informações sobre possíveis interações entre estes análogos de nucleósidos fluorescentes e um conjunto de proteínas, demonstrando uma alta probabilidade de interação com proteínas envolvidas no metabolismo de purinas e pirimidinas, bem como vias de sinalização. Este trabalho revelou compostos com grande potencial de marcação fluorescente de organelos e a sua dinâmica, bem como viabilidade celular. Há também potencial para inibição da ATPase e modulação do tempo de vida. Estas moléculas prospectam aplicações interessantes em investigação científica e também na medicina como inibidores de ATPase.
Fluorescent nucleoside analogues have been extensively used for scientific and biomedical purposes owing to their photophysical properties. Specifically, these analogues can interact with the cellular machinery due to structural and chemical similarities to endogenous biomolecules, providing means to explore target-ligand interactions, as well as fluorescently label proteins, nucleic acids, and organelles. New fluorescent purine and pyrimidine derivatives exhibiting interesting photophysical and photochemical properties, such as high quantum yield, large Stokes shift, and absorption and emission wavelengths in the visible portion of the spectrum, were synthesized. These characteristics make them auspicious molecules to be used as fluorescent probes for biological applications. Here, thirty-two purine and pyrimidine derivatives were evaluated for their fluorescent probing capabilities, using Saccharomyces cerevisiae as a model organism. The impact of these molecules on cell proliferation was evaluated in a liquid culture assay. Most compounds did not interfere with the growth rates of yeast at 500 µM, except for some particular cases. Previous studies indicated a possible interaction between these purine and pyrimidine derivatives and the V-ATPase. To explore this possibility, an ATPase activity assay was performed. One of the compounds selected for this assay exhibited significant ATPase inhibition. A follow-up study aimed at determining the effect of these molecules on the lifespan of yeast, since normal V-ATPase activity is necessary for an extended lifespan. From nine compounds tested, eight increased yeast lifespan substantially while one slightly reduced lifespan. Epifluorescence microscopy was used to evaluate the fluorescent probing potential of the subject molecules under different conditions, revealing diverse staining patterns ranging from accumulation in the vacuolar lumen, to vacuolar membrane labelling, and possibly the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and endocytic vesicles. Some compounds were also evaluated with different fixation techniques and the obtained results suggest that the compounds localize in the mentioned organelles in a mechanism requiring metabolic activity. Additionally, one compound was found to be a promising viability dye, since it presented an identical behaviour as propidium iodide in a live/dead fluorescence assay. A molecular docking screening was used to provide insights into possible interactions between these fluorescent nucleoside analogues and a set of proteins, demonstrating a high probability of interaction with proteins involved in purine and pyrimidine metabolism, as well as signalling pathways. This work unveiled compounds with great fluorescent probing potential of organelles and their dynamics, as well as cellular viability. There is also potential for ATPase inhibition and lifespan modulation. These molecules prospect interesting applications in scientific research, and also in medicine as ATPase inhibitors.