Antioxidant and cytotoxic activity of portuguese propolis

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas
O própolis é uma mistura resinosa e balsâmica natural produzida por abelhas rica em flavonóides e compostos fenólicos, que são geralmente associados às atividades antioxidante, citotóxica e antimicrobiana. Mesmo sendo o própolis um produto reconhecido e bem estudado mundialmente, ainda há poucos estudos sobre o própolis português, sendo este um produto subvalorizado. O presente trabalho é uma extensão de trabalhos realizados anteriormente sobre o própolis português do apiário do Pereiro, Beira Alta. Nesses trabalhos foi observada uma diferença nos efeitos de extratos etanólicos de amostras colhidas em 2010 (P10.EE) e em 2013 (P13.EE) no modelo biológico Saccharomyces cerevisiae, sendo que P13.EE apresentava um efeito pouco citotóxico e um efeito antioxidante, enquanto P10.EE se apresentou bastante citotóxico e pouco antioxidante. Estas diferenças entre amostras do mesmo apiário levaram à questão de quais seriam os seus mecanismos de ação e o que os causaria. Os resultados anteriores sugeriram que o P10.EE induz um tipo de morte celular regulada, que poderia ser apoptótica ou necrótica, e, também, que este extrato causa danos no DNA. No presente estudo, no caso do P13.EE, os resultados de viabilidade e de análise da oxidação intracelular por citometria de fluxo com a estirpe parental BY4741 e mutantes deficientes na resposta ao stresse oxidativo demonstraram um efeito anti e pró oxidante dependente da concentração, possivelmente devido à presença de ester fenetil do ácido cafeico, pinobanksina e pinocembrina no extrato, apresentando atividade antioxidante em concentrações menores, que, por sua vez parece estar envolvida com a eliminação direta de radicais livres e a ativação das defesas antioxidantes celulares. Já no estudo de P10.EE, os resultados de ensaios distintos de microscopia de fluorescência com os marcadores 4’,6-diamino-2-fenil-indol e iodeto de propídio sugeriram que o extrato não causa morte celular por apoptose, mas sim por uma via necrótica. A análise do ciclo celular por citometria de fluxo indicou que o extrato causa uma paragem reversível nas fases G1/S do ciclo celular. Em suma, P13.EE e P10.EE exibem atividades antioxidante e citotóxica, respetivamente; porém, tais diferenças não estarão relacionadas com o seu teor fenólico, uma vez que os cromatogramas das análises cromatográficas de ultra eficiência de P10.EE e P13.EE não revelaram diferenças entre os dois extratos. Este estudo contribuiu para um maior conhecimento dos seus mecanismos de ação, para o crescimento do valor nacional deste produto português, e para a sua possível aplicação em diversas indústrias.
Propolis is a natural resinous and balsamic mixture made by honeybees, rich in flavonoids and phenolics, which are generally associated with propolis’ antioxidant, cytotoxic and antimicrobial activities. Although propolis is generally recognized and well-studied worldwide, Portuguese propolis research is still scarce and this product is nationally undervalued. The present work is an extension to previous works on Portuguese propolis from the Pereiro apiary, located in Beira Alta. Ethanol extracts of Pereiro propolis samples harvested in 2010 (P10.EE) and 2013 (P13.EE) were found to have different effects on the biological model Saccharomyces cerevisiae, with P13.EE presenting a low cytotoxic effect and a promising antioxidant effect, while P10.EE exhibited high cytotoxicity and very low antioxidant effects. These intriguing differences in samples from the same apiary led to the question of what their mechanisms of action could be and what could be causing these differences. The previous studies were able to hint on the P10.EE mechanism of action, inferring that the extract induces a type of regulated cell death, that could either be apoptotic or necrotic, and that it also causes DNA damage. In the present work, regarding the study of the P13.EE, results from viability assays and flow cytometry intracellular oxidation analysis with the parent strain BY4741 and derived mutants with a deficient oxidative stress response suggested a dose-dependent anti and pro-oxidant effect, that could be related to the presence of compounds like caffeic acid phenethyl ester, pinobanksin and pinocembrin in the extract, presenting antioxidant activity at lower concentrations, which in turn appears to result from both direct radical scavenging and activation of the cellular antioxidant defenses. Regarding the study of P10.EE, results from separate fluorescent microscopy assays with 4’,6-diamidino-2-phenylindole and propidium iodide staining suggested that the extract is not inducing cell death through apoptosis but instead through a necrotic pathway. Cell cycle analysis through flow cytometry indicated that P10.EE causes a reversible arrest in the G1/S cell cycle phases. In conclusion, P13.EE and P10.EE exhibit promising antioxidant and cytotoxic activities, respectively, but these differences are probably not related to their phenolic content, since the chromatograms from the ultra-performance chromatographic analysis of both extracts did not reveal differences between the two. This study was able to successfully uncover parts of their intriguing mechanisms of action, contributing to the growth of Portuguese propolis national value and their possible applications in various industries.