Analisi della variabilità genetica al locus Mannose binding lectin (MBL) e studi di associazione genotipo/fenotipo contro la Brucella melitensis nella specie caprina

Il gene MBL codifica per una proteina (Mannose Binding Lectin) che ha una funzione determinante nel sistema del complemento. Tale proteina lega specificamente residui di mannosio, fucosio e di altri zuccheri presenti sulle superfici cellulari di patogeni, ma assenti nei vertebrati. In questo modo la MBL è in grado di discriminare il tipo di membrana di attacco e innescare l'attivazione del complemento esclusivamente sulla superficie del patogeno. Lo scopo della presente ricerca è stato lo studio della variabilità genetica al locus MBL nella specie caprina finalizzata all’individuazione di marcatori utili per studi di associazioni alla resistenza nei confronti della Brucella melitensis. Per 3 capre appartenenti ad una popolazione locale allevata in provincia di Catanzaro, è stato sequenziato il gene MBL dal 1° nucleotide del 1° esone al 417° nt del 4° esone per un totale di 3538 bp più 978 basi della regione 5’ UT. Tale gene è organizzato in 4 esoni e 3 introni. L’ORF (Open Reading Frame) codifica per 249 residui aminoacidici, mentre il peptide leader è costituito da 19 aminoacidi. Dal confronto tra le sequenze ottenute dai tre soggetti esaminati sono stati evidenziati un totale di 12 SNP. Al fine di effettuare una genotipizzazione e verificare se esista o meno un’associazione tra tali SNP e la resistenza alla Brucella melitensis sono state scelte 5 delle 12 mutazioni individuate. Delle 5 mutazioni, 4 (G→A-892, C→A-62, G→A116ex2, T→G190int2) sono strettamente associate (fase cis) e, quindi, possono essere considerate come un unico locus biallelico: A e B. La mutazione G→A-802 è stata esclusa in quanto presente con bassa frequenza nella popolazione esaminata. Il fenotipo per ciascun soggetto in esame è stato ottenuto attraverso la determinazione dell’attività antimicrobica verso la Brucella melitensis in vitro, sulla base della differenza tra il valore logaritmico ottenuto dalla conta delle colonie sviluppatesi su una piastra contenente siero sottoposto a trattamento termico per disattivare le proteine del sistema del complemento (siero non attivo) ed una contenente siero non sottoposto a trattamento (siero attivo). I dati ottenuti su un totale di 218 sieri individuali di capra vanno da un minimo di 0,01, che indica la massima suscettibilità al patogeno ad un valore di 1,47 che rappresenta, invece, la massima resistenza. Per la realizzazione della correlazione sono state create due classi fenotipiche (0,01 a 0,74 e 0,75 a 1,47) e sono stati presi in i tre genotipi: AA, AB e BB. Successivamente, è stato calcolato il valore dell’odds ratio che permette di verificare una eventuale associazione tra genotipo e resistenza alla Brucella melitensis. Il calcolo dell’odds ratio (OR) mostra per tale ipotesi un valore pari a 0,51 per il genotipo BB vs quelli non-BB (AA + AB), con limiti di confidenza al 95% compresi tra 0,11 e 2,34. Un tale valore di OR potrebbe far ipotizzare che un individuo omozigote BB abbia una resistenza circa 2 volte superiore rispetto ai soggetti con genotipo AA e AB alla brucellosi.