Entwicklung und Anwendung eines neuen murinen intestinalen in vitro Testsystems

Der Dünndarm ist an der Aufnahme von Nahrungsbestandteilen beteiligt und liefert den ersten Kontakt zu Pathogenen. Er stellt den größten Teil des Immunsystems dar und aus diesem Grund ist es besonders wichtig, dass die unterschiedlichen Zelltypen ihren verschiedenen spezialisierten Aufgaben nachkommen. Der Darm besteht aus Krypten, wobei die intestinalen Stammzellen in der Nische sitzen und in der Lage sind in alle Zelltypen des Dünndarms - Panethzellen, enteroendokrine Zellen, Gobletzellen und Enterozyten - zu differenzieren. In dieser Arbeit wurden ausgehend von murinen intestinalen Krypten, die in vitro als Organoidkulturen expandiert wurden, neuartige Zelllinien etabliert. Für diesen Prozess wurde zunächst eine Transduktionsstrategie für die Organoidkulturen optimiert und insgesamt 42 neue Zelllinien immortalisiert. Nachfolgend wurden die immortalisierten Zellen auf die Expression von verschiedenen Zelltyp-spezifischen Eigenschaften untersucht, um die vielversprechendsten Zelllinien zu identifizieren. Aus den initialen Charakterisierungen wurden ca. 10 Linien ausgewählt, die eingehender charakterisiert wurden. Dabei zeigte sich, dass die Zelllinien enge Zell-Zell-Kontakte aufwiesen, die durch Zonula Occludens-1 (ZO-1) und Ecadherin Expression sowie mittels einer Barrieremessung nachgewiesen wurden. Weiterhin konnte mithilfe der Elektronenmikroskopie gezeigt werden, dass die Zellen teilweise Mikrovilli ausbildeten. Außerdem zeichneten sich die Zelllinien durch eine für Gobletzellen-charakteristische Schleimproduktion aus, die sowohl auf RNA und Proteinebene als auch funktional nachgewiesen wurde. Zudem zeigten die Zelllinien Markerexpression von enteroendokrinen Zellen (Serotonin-Sekretion) und von Panethzellen (Defensin, Lysozym, CD24-Expression). Abschließend wurden die Zellen erneut in komplexe 3D-Umgebung überführt und bildeten Organoid-Strukturen aus. Die Daten deuten darauf hin, dass die neuartigen Zelllinien nicht terminal differenziert sind, sondern Vorläuferzellen. Um die generelle Anwendbarkeit dieser Zellen zu verbessern, wurde ein Medium neu entwickelt, welches die zellulären Eigenschaften erhält. Darüber hinaus konnte in einer ersten Studie mit einem enteropathogenen E. coli (EPEC) gezeigt werden, dass durch das TypIII-Sekretionssystem die zelluläre Barriere aufgelöst wird und der Erreger den Wirt infizieren kann.
The small intestine is responsible for nutrient uptake und provides the first contact to invading pathogens. It represents the largest part of the immune system and that´s why it´s very important to have different cell types with specialized functions. The intestine consists of crypts which are localized at the bottom of the stem cell niche where they can differentiate in all other cell types – Paneth cells, enteroendocrine cells, Goblet cells and enterocytes. In this work new cell lines were established from murine intestinal crypts, which were expanded in vitro at the beginning. For this purpose the transduction strategy has to be optimized and adapted to the organoid culture. All in all 42 new cell lines were immortalized. Afterwards the immortalized cells were analyzed for their cell type specific functions and for the identification of the most promising cell lines. From the initial characterizations 10 cell lines were selected for the more detailed investigation. Some of the cells show strong cell-cell-contacts, verified by the expression of ZO-1 and Ecadherin as well as the measurement of the transepithelial electrical resistance (TEER). Moreover it was observed via electron microscopy that some cell lines show microvilli on top of their cell surfaces. Furthermore they show mucus production typical for goblet cells in their RNA as well as protein expression and in functional analysis. The immortalized cells express serotonin in a site-directed manner specific for enteroendokrine cells and also CD24, Defensin and Lysoyzym characteristic for Paneth cells. Finally the cells were seeded again in their complex 3D environment to check for stem cell capacity and it visible that some cells were able to form organoid structures. The data suggest that these novel cell lines are not terminal differentiated but precursor cells. To improve the general applicability a new defined medium was established by at the same time maintaining cellular properties. In addition an infection study with enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) was performed to show the disruption of the epithelial barrier and infection of host cells because of the type III secretion system.