Development of a reference method for the quantification of heamoglobin by means of surface-enhanced Raman spectroscopy on immunoassays

Die Hämoglobinkonzentration in Blut ist einer der am häufigsten gemessenen Parameter. Für Hämoglobin ist die am häufigsten eingesetzte Messmethode die Cyanmethämoglobinmethode. Diese ist nicht auf das internationale Einheitensystem rückgeführt. Die Entwicklung von Verfahren, die eine metrologische Rückführbarkeit gewährleisten, ist in den letzten stark in den Vordergrund der Aktivitäten nationaler Metrologieinstitute gerückt. In dieser Arbeit wurde daher versucht einen vergleichbaren Immunoassay, basierend auf der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie zu entwickeln. Die Kombination mit der Isotopenverdünnung (ID) ermöglicht präzise Messungen in selbst kleinsten Konzentrationsbereichen. Die Detektion des Hämoglobins erfolgt indirekt durch die Verwendung des ramanaktiven Markers 5,5′-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB) welcher auf Goldnanopartikeln mit einem Durchmesser von 40 nm immobilisiert wurde. Neben DTNB in nativer Form wurde für die Durchführung der ID ebenfalls ein isotopenangereichertes Analogon benötigt. Für einen erfolgreichen Immunoassay wurden weitere Funktionalisierungen der AuNP mit monoklonalen Antikörpern und einem zertifizierten Hämoglobin mit bekannter Konzentration durchgeführt. Die Funktionalisierungen der AuNP wurden eingehend mit Verfahren wie der UV/Vis-Spektroskopie, der Agarose-Gelelektrophorese und der Röntgenkleinwinkelstreuung untersucht. Der Nachweis der Spezifizität von monoklonalen sowie polyklonalen Antikörpern für Hämoglobin wurde mittels Gelelektrophorese überprüft. Für die Realisierung der ID wurden die AuNP entweder mit DTNB (+ Antikörper, + Hämoglobin) oder mit DTNB* (+ Antikörper, + Hämoglobin) in bestimmten äquidistanten Verhältnissen gemischt. Das höhere molekulare Gewicht des führt zu einer Verschiebung der Raman-Spektren, die in Kombination mit den Mischungsverhältnissen eine Bestimmung der (unbekannten) Proteinkonzentration ermöglicht. Durch die Kenntnis der für die Mischungsverhältnisse verwendeten Mengen (Nanopartikel, DTNB und Hämoglobin) kann eine Berechnung der unbekannten Konzentration erfolgen. Es wurden verschiedene Oberflächen wie Cellulosenitrat-Membranen und Glaswafer zum Immobilisieren getestet. Glaswafer zeigten sich als zielführend und ermöglichten die Erstellung eines Testformates des SERS-Immunoassays. Aufgrund der Problematik einer Aggregation der Partikel kann das Testformat des ID-SERS-Immunoassays nur eingeschränkt verwendet werden.
Haemoglobin is one of the most frequently measured parameters in laboratory medicine. The only approved method for the detection of haemoglobin concentration the cyanmethaemoglobin method is not traceable to the SI. In general, there are severe problems in comparability of results in clinical laboratories and they can vary depending on the used testing kit. Raising from the problem of this lacking comparability and traceability the scope of this research was the development of a SERS-Immunoassay in combination with the Isotope Dilution approach which, is capable of an SI traceable quantification of haemoglobin. The detection of haemoglobin was performed indirect due to the usage of the strong Raman active marker DTNB. The aimed quantification of haemoglobin required additionally an isotopic enriched analogue of this marker. The used spherical goldnanoparticles with a size of 40 nm were functionalized with DTNB and its isotopologue and specific antibodies targeted against haemoglobin. The functionalization could be proved with different methods like UV/Vis, SAXS and agarose gel-electrophoresis. The specificity between antibodies and haemoglobin was successfully tested with Western blotting. This nanoparticle antibody complex was able to specific bind the haemoglobin and could be immobilized on a functionalized nitrocellulose membrane. The nitrocellulose-based approach appeared not to be suitable for a further development of the Immunoassay and an alternative was chosen. Due to these reasons an alternative approach with modified glass slides was executed. The alternative approach managed to minimize potential nanoparticle aggregation. With the achieved spectra a first try for a successful calibration model was made but with some limitations of the model itself. There are noticeable differences between the model based on the nitrocellulose membrane and the slides. Despite the influences of the nanoparticles, the ID-SERS-Immunoassay can be the basis for a further improvement of the quantification model for haemoglobin.