Klonierung von O-Methyltransferasen zur Furanocumarinbiosynthese in Ammi majus L

Plants belonging to the Apiaceae or Rutaceae accumulate methoxylated psoralens, such as bergapten or xanthotoxin, as the final products of their furanocumarin biosynthesis, and the rate of accumulation depends on environmental and other cues. Distinct O-methyltransferase activities had been reported to methylate bergaptol to bergapten and xanthotoxol to xanthotoxin, from induced cell cultures of Ruta graveolens, Petroselinum crispum and Ammi majus. Bergaptol 5-O-methyltransferase (BMT) cDNA was cloned from dark-grown Ammi majus L. cells treated with a crude fungal elicitor. The translated polypeptide revealed considerable sequence similarity to heterologous caffeic acid 3-O-methyltransferases (COMTs). For homologous comparison, COMT was cloned from A. majus plants and shown a 64% identity with the BMT sequence at the polypeptide level. Functional expression of both enzymes in Escherichia coli revealed that the BMT activity in the bacterial extracts was labile and rapidly lost on purification, whereas theCOMT activity remained stable. Furthermore, the recombinant AmBMT showed narrow substrate specificity for bergaptol, while the AMCOMT accepted 5-hydroxyferulic acid, esculetin and other substrates. The AmBMT sequence thus represents a novel database accession specific for the biosynthesis of psoralens.
Vertreter der Apiaceae oder Rutaceae akkumulieren methoxylierte Psoralene wie Bergapten oder Xanthotoxin als Endprodukte der Furanocumarinbiosynthese. O-Methyltransferase-Aktivitäten mit Umsetzungen von Bergaptol zu Bergapten bzw. Xanthotoxol zu Xanthotoxin wurden bereits aus induzierten Zellkultursystemen von Ruta graveolens, Petroselinum crispum und Ammi majus beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bergaptol 5-O-Methyltransferase (BMT) als erstes Enzym der Furanocumarinbiosynthese aus Ammi majus L. in ihrer cDNA und Aminosäuresequenz aufgeklärt und biochemisch charakterisiert. Das translatierte Polypeptid zeigte hohe Sequenzhomologien zu heterologen Kaffeesäure 3-O-Methyltransferasen (COMTs). Daher wurde zum Sequenzvergleich eine COMT aus Ammi majus L. Pflanzen kloniert, die 64% Identität zur BMT auf Aminosäureebene aufweist. Die funktionelle Expression beider Enzyme in Escherichia coli zeigte, dass die BMT Aktivität in bakteriellen Rohextrakten labil ist und beim Anreinigen verloren geht. Die COMT Aktivität dahingegen bleibt stabil. Während die BMT eine hohe Spezifität für ihr Substrat Bergaptol aufweist, methyliert die COMT 5-Hydroxyferulasäure, Esculetin und weitere Substrate. Die BMT-Sequenz aus Ammi majus stellt einen neuen spezifischen Zugang auf molekularer Ebene zur Biosynthese der Furanocumarine dar.