Impact of Mutations at Arg220 and Thr237 in PER-2 β-Lactamase on Conformation, Activity, and Susceptibility to Inhibitors

PER-2 accounts for up to 10% of oxyimino-cephalosporin resistance in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Argentina and hydrolyzes both cefotaxime and ceftazidime with high catalytic efficiencies (kcat/Km). Through crystallographic analyses, we recently proposed the existence of a hydrogen bond network connecting Ser70-Gln69-oxyanion water-Thr237-Arg220 that might be important for the activity and inhibition of the enzyme. Mutations at Arg244 in most class A β -lactamases (such as TEM and SHV) reduce susceptibility to mechanism-based inactivators, and Arg220 in PER β -lactamases is equivalent to Arg244. Alterations in the hydrogen bond network of the active site in PER-2, through modifications in key residues such as Arg220 and (to a much lesser extent) Thr237, dramatically impact the overall susceptibility to inactivation, with up to 300-And 500-fold reductions in the rate constant of inactivation (kinact)/Kivalues for clavulanic acid and tazobactam, respectively. Hydrolysis on cephalosporins and aztreonam was also affected, although to different extents compared to with wild-Type PER-2; for cefepime, only an Arg220Gly mutation resulted in a strong reduction in the catalytic efficiency. Mutations at Arg220 entail modifications in the catalytic activity of PER-2 and probably local perturbations in the protein, but not global conformational changes. Therefore, the apparent structural stability of the mutants suggests that these enzymes could be possibly selected in vivo. Fil: Ruggiero, Melina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; Argentina Fil: Curto, Lucrecia María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Química Biológica; Argentina Fil: Brunetti, Florencia Lourdes. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; Argentina Fil: Sauvage, Eric. Université de Liège; Bélgica Fil: Galleni, Moreno. Université de Liège; Bélgica Fil: Power, Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; Argentina Fil: Gutkind, Gabriel Osvaldo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; Argentina