Ferritin gene expression and antioxidant response of two Coffea arabica cultivars exposed to iron and aluminium

Orientador: Paulo Mazzafera Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A ferritina é uma proteína que armazena átomos de ferro (Fe) em uma forma não tóxica, controlando o nível desse metal nas células. Em humanos, a ferritina também é capaz de se ligar ao alumínio (Al), evitando sua toxicidade. Como o cafeeiro consegue crescer adequadamente em solos ácidos, com níveis elevados de Al, e células em suspensão tratadas com esse mesmo metal têm expressão aumentada de genes que codificam para ferritina, há a possibilidade dessa proteína se complexar ao Al também em plantas. Na indução da síntese da ferritina em suspensões celulares de Coffea arabica cv. Mundo Novo com 300 e 1.200 µmol/L de sulfato ferroso observou-se um aumento de 8,9 e 18,2 vezes, respectivamente, do RNAm CaFer1 da ferritina, em relação ao controle. Já o tratamento com 5 mmol/L de sulfato de alumínio-potássio resultou na diminuição de 4,57 vezes na expressão desse gene, em relação ao controle. Para Coffea arabica cv. Icatu, todos os tratamentos resultaram na queda da expressão de CaFer1, sendo que essa diminuição foi de 29,0 e 6,3 vezes para as células tratadas com 300 e 1.200 µmol/L de sulfato ferroso, respectivamente, e de 98,0 vezes para o tratamento com 5 mmol/L de sulfato de alumínio-potássio, em relação ao controle. Esses mesmos tratamentos não induziram, em ambas as cultivares, expressão diferencial significativa de outro gene da ferritina analisado, o CaFer2. Os resultados do Western Blot mostraram certa concordância com esses resultados. Assim como em outras plantas, a ferritina de células em suspensão de cafeeiro responde à presença do Fe, entretanto, devido ao não acúmulo dessa proteína nas células submetidas ao tratamento com 5 mmol/L de sulfato de alumínio-potássio, provavelmente, a ferritina não esteja envolvida na complexação desse metal no cafeeiro ou a concentração utilizada foi elevada, o que pode ter causado danos nos ácidos nucléicos ou impedido a transcrição normal dos genes. Nas análises in silico utilizando CaFer1 e CaFer2 de C. arabica e os genes da ferritina de C. canephora e C. racemosa, observaram-se alta similaridade entre CaFer1 e a ferritina de C. canephora e entre CaFer2 e a ferritina de C. racemosa. Por fim, os ensaios com as enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa S-transferase (GST), glutationa redutase (GR) e guaiacol peroxidase (GPOX) revelaram que as culturas celulares de Mundo Novo foram mais responsivas aos tratamentos aplicados, exceto em relação à GST, que foi a enzima que apresentou atividade mais acentuada para Icatu. Além disso, observou-se que a resposta enzimática foi dose dependente e que as duas cultivares utilizaram vias distintas para defesa celular contra espécies ativas de oxigênio. Abstract: Ferritin is a protein capable to store iron (Fe) atoms in a nontoxic form, controlling the level of this metal in the cells. In humans, ferritin is able to accommodate aluminium (Al) atoms, avoiding its toxicity. Considering that Coffea arabica plants are able to grow well in acidic soils with high Al and suspension cells treated with this same metal showed high ferritin gene expression, it is possible that this protein is also able to complex Al atoms in planta. The induction of ferritin synthesis in suspension cells of C. arabica cv. Mundo Novo with 300 and 1.200 µmol/L of ferrous sulphate revealed an increase of 8,9 and 18,2 times, respectively, of transcripts of ferritin gene CaFer1, as compared with the control. The treatment with 5 mmol/L of aluminium-potassium sulphate resulted in the reduction of 4,57 times the expression of this gene, as compared with the control. In cells from the Icatu cultivar all treatments resulted in reduction of the expression of CaFer1. This decrease was about 29,0 and 6,3 times in cells treated with 300 and 1.200 µmol/L of ferrous sulphate, respectively, and 98,02 times in the treatment with 5 mmol/L of aluminium-potassium sulphate, as compared with the control. For both varieties, these same treatments did not result in significant differential expression of the other ferritin gene analyzed, CaFer2. Western Blots data were in agreement with this observation. Therefore, ferritin expression in suspension cells of Coffea plants responds to Fe, as shown for other plants, however, on account of the no accumulation of ferritin in both cultivars treated with 5 mmol/L of aluminium-potassium sulphate, possibly this protein is not involved with Al complexation in C. arabica plants or the level of Al used was sufficiently high to provoke damages in the nucleic acids or to impair the normal transcription of the genes. An in silico analysis carried out with CaFer1 and CaFer2 from C. arabica and with ferritin genes of the Coffea canephora and Coffea racemosa revealed high similarity between CaFer1 and C. canephora ferritin, and CaFer2 with C. racemosa ferritin. Finally, assays of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione S-transferase (GST), glutathione reductase (GR), and guaiacol peroxidase (GPOX) revealed that cell cultures of the Mundo Novo variety are more responsive to the treatments with the metals, except for GST, wich was the only enzyme with higher activity in cells from the Icatu cultivar. Furthermore, it was observed that enzymatic response was dose dependent and that Mundo Novo and Icatu used distinct mechanisms to protect cells against reactive oxygen species. Mestrado Mestre em Biologia Vegetal