Identifizierung einer Funktion des Transkriptionsfaktors LMX1B bei der Regulation des Interferon-beta-Signalwegs

LMX1B ist einer der wenigen Transkriptionsfaktoren, für die bisher eine wichtige Rolle in Podozyten nachgewiesen werden konnte. Podozyten sind eine unverzichtbare Komponente der glomerulären Filtrationsbarriere in der menschlichen Niere. So leiden Patienten mit Nagel-Patella-Syndrom - einer autosomal-dominant vererbten Krankheit, bei der das LMX1B-Gen mutiert ist - auch häufig unter einer Nephropathie. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Funktion von LMX1B in der Zelle näher zu charakterisieren. Dazu wurden zunächst HeLa-Zelllinien, die den Wildtyp und verschiedene Mutanten des LMX1B-Proteins mittels Tet-off-System regulierbar produzieren, eingesetzt. Wie frühere Arbeiten bereits zeigten, übt LMX1B einen wachstumsinhibierenden Effekt auf HeLa-Zellen aus. Nun konnte mittels BrdU-Inkorporation abgesichert werden, dass dieser Effekt nicht auf Apoptose sondern auf eine Verzögerung des Zellzyklus zurückzuführen ist. Außerdem wurde eine frühere Studie, die den beiden proteinbindenden LIM-Domänen eine essentielle Bedeutung bei dieser Funktion LMX1Bs zuwies ohne auf jede einzeln einzugehen, nun weitergeführt. Dabei stellte sich im LDH-Assay mit einer LMX1B-Mutante, der die LIM1-Domäne fehlt, heraus, dass diese Domäne für die Wachstumsinhibition verzichtbar und demnach die LIM2-Domäne für den Effekt ausreichend ist. Die weiteren Untersuchungen beschäftigten sich mit der transkriptionsregulatorischen Funktion von LMX1B. Dabei konnte, ebenfalls im HeLa-Zellsystem, eine bisher unbekannte Funktion von LMX1B bei der Regulation von NF-kB-Zielgenen aufgedeckt werden. Wie eine RT-qPCR-Analyse zeigte, induziert LMX1B in diesen Zellen die Expression einer Reihe von NF-kB-Zielgenen wie IFNb, IL-6, IL-1b und IL-8. Der dieser Induktion zugrunde liegende Mechanismus ist Gegenstand der laufenden Forschung der Arbeitsgruppe. Wie indirekt durch Verwendung eines neutralisierenden Antikörpers gezeigt werden konnte, führt die durch LMX1B ausgelöste erhöhte IFNb-Expression zu einer ebenfalls erhöhten Synthese des Interferon-beta-Proteins. Diese induziert, wie die RT-qPCR zeigte, über den JAK/STAT-Signalweg die Expression diverser klassischer Interferon-induzierter Gene wie G1P3 und ISG15, aber auch die von Genen für Proteine, die an einer positiven Rückkopplung beteiligt sind. Hierzu gehören STATs, IRFs, PKR und Toll-like-Rezeptoren. Interferon-beta, Interleukin-6 und die Produkte vieler ISGs besitzen wachstumshemmende Eigenschaften, weshalb der wachstumsinhibierende Effekt LMX1Bs in HeLa-Zellen auf deren verstärkte Synthese zurückzuführen sein könnte. Weiterführende Studien weisen jedoch inzwischen darauf hin, dass die ebenfalls durch RT-qPCR-Analyse detektierte Verminderung der c-Myc-Expression und Verstärkung der p21-Expression hier eine bedeutendere Rolle spielen. Die erhöhte Expression von p21 könnte dabei durch die verminderte Synthese von c-Myc ausgelöst werden, da c-Myc normalerweise p21 hemmt. Bei Podozyten handelt es sich um hochdifferenzierte Zellen, die selbst bei Beschädigung des Glomerulus in der Regel nicht mehr proliferieren. Eine der hauptverantwortlichen molekularen Komponenten dieses Phänomens ist der Cdk-Inhibitor p21. Möglicherweise spielt auch hier die Genregulation und Wachstumshemmung durch LMX1B eine Rolle. Die bei Podozyten als Reaktion auf Beschädigung ihres Epithels häufig entwickelte Hypertrophie, eine Vergrößerung des Zellvolumens nach Eintritt in den Zellzyklus ohne anschließende Zellteilung, konnte auch bei LMX1B-produzierenden HeLa-Zellen beobachtet werden. Auch in vivo, in den Nieren neugeborener Mäuse beeinflusst LMX1B die Expression von Genen des Interferon-beta-Systems. Sein Effekt ist hier jedoch hemmender Natur, wie die Untersuchung von Lmx1b-Knockout- und Wildtyp-Tieren zeigte. In der Niere adulter Tiere konnte kein Einfluss von Lmx1b festgestellt werden, demnach scheint dieser nur während der embryonalen Entwicklung von Bedeutung zu sein. Eine Rolle von Lmx1b bei der murinen Immunreaktion deutet sich durch die Beobachtung an, dass Lmx1b auch im Thymus neugeborener Mäuse die Expression eines ISGs hemmt. Wie sich mittlerweile abzeichnete, scheint die Regulation der NF-kB-Zielgene für Entwicklung des murinen Auges von größerer Relevanz zu sein als für die der murinen Niere. Die im Rahmen dieser Arbeit entdeckte Rolle von LMX1B bei der Induktion von NF-kB-Zielgenen in HeLa-Zellen eröffnet ein weites, spannendes Feld für die weitere Erforschung seiner Funktion. Die Tatsache, dass Lmx1b auch in vivo im Maus-Modell die Expression von NF-kB-Zielgenen und Genen des Interferon-beta-Signalwegs beeinflusst, lässt auf eine Relevanz beim Menschen und bei der Erforschung des Nagel-Patella-Syndroms hoffen.
LMX1B is a transcription factor that plays an important role in podocytes. Patients with mutations in the gene for LMX1B suffer from nail-patella-syndrome. It was the aim of this work to better characterize the function of LMX1B in the cell. Overexpression of LMX1B inhibits the proliferation of HeLa-cells. A BrdU-incorporation assay confirmed that a delay of the cell cycle and not apoptosis is responsible for the effect. Furthermore, an LDH-assay showed that the LIM2-domain but not the LIM1-domain is essential for the growth inhibition. RT-qPCR analysis also using the HeLa-cell Tet-off expression system revealed a so far unknown function of LMX1B with the regulation of NF-kappa B target genes. LMX1B induces the expression of several NF-kappa target genes e.g. IFNb, IL-6, IL-1b and IL-8. The increased expression of the interferon beta-gene leads to an increased synthesis of the interferon beta-protein. Via the JAK/STAT this induces the expression of classical interferon-stimulated genes (ISGs) such as G1P3 and ISG15 and of genes that play a role in a positive feedback such as genes for STATs, IRFs, PKR and Toll-like receptors. In vivo, namely in the kidney of newborn mice, Lmx1b also influences the expression of genes belonging to the IFNb-system. However, as comparison of wildtype- and knockout-animals showed, the effect of Lmx1b on these genes is inhibiting. This function of Lmx1b in the mouse model raises the hope for a relevance of the described findings in patients with nail-patella-syndrome.